《Journal of Proteome Research》：Proteomic and Secretomic Response of an African Armillaria Species to Iron
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本文首次报道了非洲蜜环菌CMW4456菌株在铁响应下的蛋白质组与分泌组学研究。通过无凝胶、无标记的LC-MS/MS定量蛋白质组学与蛋白基因组学联用，揭示了铁补充（100 μM FeCl3）显著改变其参与中心代谢（如TCA循环、PPP途径）、氨基酸合成及菌丝生长的蛋白丰度，同时发现了三个推测的铁载体生物合成基因簇（BGCs）。研究表明，该浓度铁处理未引发明显的氧化应激反应，这为理解蜜环菌铁稳态机制提供了新见解。研究进一步指出，靶向其琥珀酸脱氢酶（SDH）、转酮醇酶（transketolase）以及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸合成通路，可为控制其致病性或开发相关生物技术应用提供新策略。
本研究旨在探究非洲蜜环菌（Armillariasp.）菌株CMW4456在铁响应下的蛋白质组与分泌组变化，以增进对该真菌铁稳态机制及其与致病性潜在关联的理解。
培养条件与菌株生长
研究采用液体马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基，设置了缺铁（PDP–）和补铁（100 μM FeCl3·6H2O， PDP+）两种条件培养菌株CMW4456。结果表明，补铁显著促进了菌丝生长，在PDP+条件下培养物的鲜重（0.501–0.556克）几乎是缺铁条件（0.311–0.376克）下的两倍。同时，使用改进的铬天青S（CAS）法测定铁载体生物合成，结果显示两种条件下铁载体产量（以百分数表示）无显著差异（PDP+：42.94 ± 1.39； PDP–：42.77 ± 0.5），表明培养基中添加100 μM的铁并未抑制该菌的铁载体产生。
蛋白质组与分泌组的整体特征
研究使用无凝胶、无标记的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，结合MaxQuant和Andromeda搜索引擎进行数据处理。在缺铁和补铁的菌丝体蛋白质组中，分别鉴定到2360-2453和2498-2509个蛋白质；在相应的分泌组中，分别鉴定到379-463和393-448个蛋白质。大多数检测到的蛋白质分子量在30-40 kDa范围内。
主成分分析（PCA）清晰地展示了补铁和缺铁条件下蛋白质组与分泌组的显著差异，各处理组的生物学重复也显示出良好的重复性。
差异表达蛋白（Differentially expressed proteins, DEPs）分析显示，补铁与缺铁相比，在蛋白质组中有167个DEPs，其中107个表达上调，60个表达下调；在分泌组中则有15个DEPs，其中13个表达下调。
差异表达蛋白的功能分析
对DEPs进行功能注释和分类，揭示了铁响应的主要生物学过程。
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基因本体（GO）分类：在Mre vs Mde比较组中，DEPs主要富集在“细胞过程”、“代谢过程”（BP）、“细胞”、“细胞器”（CC）以及“催化活性”、“结合”（MF）等GO条目。Sre vs Sde比较组也显示了类似的模式，但涉及的条目数量更少。
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真核生物直系同源群（KOG）分类：在Mre vs Mde比较组中，DEPs广泛分布于“代谢”、“信息储存与处理”及“细胞过程和信号转导”等KOG功能类别中，其中“一般功能预测”（poorly characterized）类别包含最多的蛋白（32个）。在“代谢”类别下，“能量产生与转化”、“脂质转运与代谢”以及“氨基酸转运与代谢”相关蛋白数量较多。Sre vs Sde比较组的DEPs则主要集中在“代谢”和“细胞过程与信号转导”相关功能上。
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KEGG通路富集分析：在蛋白质组中，DEPs显著富集于包括“戊糖磷酸途径（PPP）”、“次级代谢产物的生物合成”、“碳代谢”以及“柠檬酸循环（TCA循环）”等通路。其中，“戊糖磷酸途径”的富集程度最高。在分泌组中，DEPs则主要与“糖酵解/糖异生”及“抗坏血酸和醛糖酸代谢”通路相关。
中心代谢通路的改变
铁补充改变了参与中心代谢途径的蛋白质丰度。TCA循环中的多个酶（如二氢硫辛酰胺脱氢酶、二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶、延胡索酸水合酶、丙酮酸脱氢酶E1α亚基和丙酮酸羧化酶）在补铁条件下丰度增加，这与观察到的菌丝生长增强一致，因为TCA循环的增强有助于ATP的生成。然而，参与PPP和糖酵解途径的一些蛋白质（如葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶（G6PDH）、葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）和转酮醇酶（transketolase））在补铁条件下丰度却有所下降。这些蛋白在其他真菌中对氧化应激有响应，但本研究未发现典型的氧化应激反应蛋白（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-转移酶等）有显著变化，这表明添加100 μM FeCl3并未对菌株CMW4456造成氧化应激。
氨基酸合成与次级代谢
补铁还显著影响了氨基酸生物合成途径中多种酶的丰度，这通常与次级代谢产物的生成密切相关。其中，参与支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）合成的3-异丙基苹果酸脱氢酶和乙酰羟酸合酶（acetohydroxy-acid synthase）小亚基丰度增加。参与精氨酸和脯氨酸代谢的谷氨酸-5-半醛脱氢酶（glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase）以及参与赖氨酸生物合成（通过α-氨基己二酸途径）的同型柠檬酸合酶（homocitrate synthase，一种Fe/S蛋白）也在补铁后表达上调。这些酶在多种病原真菌的毒力和适应中扮演关键角色，因而被认为是潜在的抗真菌药物靶点。
菌丝生长相关蛋白
与菌丝生长增强相符，细胞骨架组织和细胞周期相关的蛋白质丰度在补铁后也发生变化。例如，微管结合蛋白（microtubule binding protein）和微管蛋白α链（tubulin alpha chain）丰度增加，它们对菌丝极性生长和细胞形态发生至关重要。此外，参与DNA复制的DNA复制许可因子MCM6（DNA replication licensing factor MCM6）以及参与细胞周期后期的蛋白激酶DBF2（protein kinase DBF2）相关蛋白的丰度也有所上升。
推测的铁载体生物合成基因簇（BGCs）及其表达
对CMW4456菌株基因组进行蛋白基因组学分析，发现了三个推测的铁载体生物合成基因簇（BGCs）：一个属于非核糖体肽合成酶（NRPS）依赖性途径，两个属于NRPS非依赖性（NIS）途径。这些BGCs在其他蜜环菌物种的基因组中被报道，显示出较高的保守性，但也存在一些基因丢失或融合事件（如主要生物合成基因的合并）。尽管在蛋白质组中检测到了这些BGCs中部分基因编码的蛋白质（如ABC转运蛋白、细胞色素P450、主要易化子超家族（MFS）转运蛋白等），但主要的生物合成基因编码的蛋白质并未被检测到，这可能受限于蛋白质组学技术对低丰度蛋白的检测能力。铁载体产量的无显著差异与这些辅助蛋白的普遍表达模式相吻合。
结论与展望
本研究首次揭示了非洲蜜环菌CMW4456菌株在铁响应下的蛋白质组与分泌组变化。在添加100 μM FeCl3的条件下，菌株的蛋白质组和分泌组发生了显著改变，这些变化主要涉及中心代谢、次级代谢、氨基酸合成及菌丝生长相关通路。重要的是，该浓度铁处理并未引发典型的氧化应激反应。研究鉴定了三个保守的铁载体BGCs，但未直接检测到其主要生物合成基因产物的表达，后续需要结合RT-qPCR与靶向代谢组学等技术进行深入验证。
研究结果不仅加深了对蜜环菌铁稳态机制的理解，更指出了一个重要的应用方向：针对蜜环菌的致病性控制。研究发现的关键蛋白，如参与TCA循环和PPP的酶、支链氨基酸合成酶（如乙酰羟酸合酶）、赖氨酸合成酶（如同型柠檬酸合酶）、以及转酮醇酶和琥珀酸脱氢酶（SDH），均可作为潜在的治疗靶点。现有的琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）类杀菌剂和转酮醇酶抑制剂，或靶向上述氨基酸合成通路的新型抗真菌物质，值得被评估用于防控致病性蜜环菌。同时，这些机制知识也可用于优化培养条件，促进蜜环菌菌丝生长及其氨基酸与次级代谢产物的生物合成，服务于制药等生物技术领域。
