大型库分子对接用于多靶点药理学的探索

《Journal of Medicinal Chemistry》：Large Library Docking for Polypharmacology

本文探讨了利用大规模分子对接技术（Large Library Docking）从头设计多靶点（Polypharmacology）分子的策略。通过回顾性与前瞻性研究，作者验证了随着化合物库容量的增长，发现能同时作用于α2A肾上腺素能受体（α2A）、血清素转运体（SERT）和μ阿片受体（MOR）等不同家族靶点配体的可能性。研究不仅成功获得了具有双重活性的先导化合物（如‘z7149’），并通过冷冻电镜（cryo-EM）验证了对接预测的准确性，更在动物模型中证实了这些分子作为非成瘾性镇痛剂及抗抑郁/抗焦虑药物的潜力，为针对复杂疾病（如疼痛、抑郁症）的多靶点药物研发提供了新思路与方法学上的重要参考。

　　

引言

许多疾病的病理过程涉及多个关键蛋白，联合靶向这些靶点可提升治疗效果，例如联合用药治疗高血压或癌症。然而，传统多药联合疗法（Polypharmacy）面临药代动力学差异、配方复杂及药物相互作用等挑战。这促使研究者转向多靶点药理学（Polypharmacology），即设计单一分子同时调节多个靶点。尽管一些上市药物（如氯氮平）意外展现出多靶点活性，但主动从头设计多靶点配体仍面临巨大挑战，尤其是在确保所需功能（如激动或拮抗）方面。基于结构的分子对接筛选是潜在方法之一，但既往研究受限于库规模，且对不相关靶点家族的成功案例有限。本研究旨在探索超大规模化合物库对接在发现作用于不同蛋白家族靶点对的多靶点配体方面的可行性、优势与挑战。

结果

回顾性研究：已知多靶点配体的富集分析

研究首先选取了三对已知共享配体的靶点：D₂多巴胺受体（D₂）与5-HT_2A血清素受体（5-HT_2A）、μ阿片受体（MOR）与κ阿片受体（KOR）、血清素转运体（SERT）与多巴胺转运体（DAT）。通过分析化合物库（ZINC22）规模增长的影响，发现随着库容量扩大，库中与已知双靶点配体相似的分子数量显著增加。对接富集分析进一步表明，在D₂/5-HT_2A靶点对中，随着库容量增至十亿级，在对接排名前0.05%的分子中，能同时富集于两个靶点的、与已知多靶点配体相似的化合物数量也大幅增长。这为前瞻性研究提供了理论依据。

前瞻性发现：新型多靶点激动剂的发现

受回顾性结果鼓舞，研究选择了三个在疼痛或抗抑郁中有重要生物学意义但结构迥异的靶点：α_2A肾上腺素能受体（α_2A，一种GPCR）、血清素转运体（SERT，一种转运蛋白）和μ阿片受体（MOR，一种GPCR）。目标是寻找能同时激活α_2A并抑制SERT、或同时激活MOR并抑制SERT、或同时激活α_2A和MOR的分子。尽管这些靶点分属不同折叠家族，但其正位结合口袋共享一些关键特征，如存在与配体阳离子基团相互作用的保守天冬氨酸（Asp）以及识别配体芳基的芳香族残基区域。

研究对包含9亿个分子的库进行了大规模对接筛选。对于α_2A/SERT和α_2A/MOR靶点对，由于α_2A口袋尺寸限制，筛选了3300万个阳离子分子；对于SERT/MOR靶点对，筛选了约9亿个阳离子分子。通过严格的后续过滤（包括内部应变能、关键相互作用缺失和聚类分析），最终分别合成了104、82和55个高排名化合物进行实验测试。

实验结果显示，对于α_2A/SERT靶点对，41个化合物与α_2A结合（命中率39%），21个抑制SERT（命中率20%），其中16个具有双重结合活性（双重命中率15%），并且有5个是α_2A激动剂。对于SERT/MOR靶点对，26个抑制SERT（命中率47%），16个结合MOR（命中率29%），其中6个具有双重结合活性（双重命中率12%），并有1个是MOR激动剂。然而，对于α_2A/MOR靶点对，未发现任何具有双重活性的配体，这可能与两个受体正位口袋尺寸差异较大有关。值得注意的是，双重结合活性率（特别是α_2A/SERT）远高于从单一靶点筛选的活性分子中随机测试另一个靶点所能获得的概率。

先导化合物的优化

研究对获得的先导化合物进行了优化。以α_2A/SERT命中化合物‘z7149（一个四氢吡啶类分子）为例，对接模型显示其在α_2A口袋中被深度包裹，修饰位点有限，而在SERT口袋中允许修饰的位置较多，但兼顾两个靶点的约束使得只有一个位置适合进行修饰。优化尝试发现，针对单个靶点的活性可以显著提升（如对SERT抑制活性提升高达150倍），但往往以牺牲另一个靶点的活性为代价。最终，对11个母体化合物合成了254个类似物，但优化双重活性仍具挑战。最佳案例来自SERT/MOR的命中化合物H8Oo，通过将N-甲基苯胺替换为酚羟基，得到了化合物‘0505，其对SERT的抑制活性（K_i）和对MOR的激动活性（EC₅₀）均提升了约6倍，分别达到250 nM和140 nM。

脱靶效应评估

对优选化合物‘z7149和‘0505进行了脱靶效应评估。两者对密切相关的转运体DAT和NET的抑制活性较弱（K_i在微摩尔范围）。在针对320个人类GPCR的Tango筛选实验中，‘0505未显示显著活性；‘z7149仅在5-HT_2B和5-HT_2C受体上表现出一定激动活性（EC₅₀分别为15 nM和26 nM，但效能较低）。总体而言，这些分子在测试中并未表现出广泛的混杂性。

冷冻电镜结构验证

为验证对接预测并指导后续优化，研究利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了‘z7149与α_2A和SERT的复合物结构，以及‘0505与MOR的复合物结构。结果显示，实验测得的配体结合模式与对接预测高度吻合。对于α_2A，‘z7149的实验结构与对接预测构象的重原子均方根偏差（RMSD）为1.22 ?，关键离子对相互作用（与Asp128）如预测所示。对于SERT，尽管受体从对接所用的向内开放构象转变为闭合封闭构象，但‘z7149仍结合在预测的位点并与相同残基相互作用。对于MOR，‘0505的实验结构也支持对接预测的构象（RMSD为2.1 ?），其酚羟基与Asp149及有序水分子形成氢键。这些结构证实了大规模对接预测结合模式的准确性。

多靶点化合物的体内活性

药代动力学（PK）研究表明，‘z7149在脑内有较好的暴露量，而‘0505的脑脊液（CSF）暴露量较低，预示其体内活性可能有限。行为学实验证实了‘z7149的体内功效。

在多种疼痛模型中（包括甩尾试验、热板试验、Hargreaves试验，以及神经病理性疼痛的坐骨神经分支选择性损伤模型和炎症性疼痛的完全弗氏佐剂模型），‘z7149在10 mg/kg剂量（腹腔注射）下表现出显著的镇痛和抗异常疼痛效果，且不会引起运动损伤或镇静。重要的是，与早期单一靶点α_2A激动剂‘9087不同，‘z7149未诱导条件性位置偏爱（CPP），这可能归功于其SERT抑制活性。

鉴于‘z7149对SERT和5-HT_2A（实验发现其对该受体也有激动活性，EC₅₀为172 nM）的双重作用，研究进一步评估了其抗抑郁和抗焦虑样活性。在四板试验中，‘z7149表现出与地西泮类似的抗焦虑样效果。在尾悬试验中，使用易感抑郁表型的VMAT2杂合子小鼠，‘z7149在0.2和0.5 mg/kg剂量下产生了持久的抗抑郁样效果，其效力和持久性优于高剂量氟西汀。

讨论

本研究展示了利用超大规模库多靶点对接发现具有双重乃至三重靶点活性分子的可行性。主要发现包括：首先，随着对接库的扩张，潜在的多靶点化合物数量自然增长，且能被对接富集。其次，针对生物学相关但结构不同的靶点对（如α_2A/SERT和SERT/MOR），前瞻性对接能够成功发现多个双重结合配体，但对于结合口袋尺寸不匹配的靶点对（如MOR/α_2A）则难以成功。第三，与单一靶点优化相比，同时优化分子对两个靶点的活性更具挑战性，往往难以兼顾。第四，尽管先导化合物效力相对较弱，但通过多靶点协同作用，仍可能产生有价值的体内药理活性，如‘z7149展示的非成瘾性镇痛及抗抑郁/抗焦虑潜力。

研究的局限性包括所得配体的效力通常低于单一靶点筛选的最佳分子，药代动力学性质有待进一步优化，且对接时未考虑受体的构象灵活性。未来，更先进的库（如万亿级）、生成式人工智能（AI）引导的分子设计、机器学习评分函数以及柔性受体对接等技术的发展，有望进一步推动多靶点药物发现领域的前进。

总之，这项研究揭示了大规模库对接在治疗复杂疾病的多靶点药物研发中的应用前景与当前挑战，为实现精准多靶点药理学设计提供了重要的方法论借鉴和实证案例。