抑制SAFB应激颗粒形成的热增敏剂Z19024498的发现及其在癌症热疗中的应用研究

《Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of Thermal Sensitizers That Inhibit Heat-Induced SAFB Granule Formation

这篇综述报道了靶向抑制热应激诱导的SAFB（支架附着因子B）颗粒形成的新型热增敏剂的发现。研究表明，化合物Z19024498能有效抑制SAFB颗粒形成，显著增强热应激诱导的细胞凋亡（apoptosis），并在荷瘤小鼠模型中与热疗（hyperthermia）联用展现出协同抗肿瘤效果，为克服肿瘤热耐受（thermotolerance）提供了新的潜在策略。

　　

引言

热疗是一种基于热应激诱导细胞凋亡的微创癌症治疗方法。然而，其疗效常受限于肿瘤异质性和获得性热耐受。因此，联合热疗与化疗的策略被开发以增强疗效。此前研究发现，SB366791能通过抑制热应激诱导的SAFB颗粒形成来增强热诱导凋亡，但其促凋亡活性不足。此外，SB366791作为TRPV1（瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1）拮抗剂，可能引起体温调节紊乱并带来副作用。因此，本研究旨在筛选功能与结构均不同于SB366791、且能通过抑制SAFB颗粒形成来增强热诱导凋亡的新型化合物。

结果

鉴定增强热应激下细胞生长抑制的化合物

为鉴定能抑制HSF1（热休克转录因子1）和/或SAFB颗粒形成的新型化合物，研究人员筛选了Enamine PDR subset 2000化合物库。基于细胞活性分析，初步鉴定出9个能显著增强热应激诱导细胞生长抑制的化合物。后续验证确定了其中4个化合物：Z19024498、Z224851224、Z220426404和Z56771262。在热应激下，Z220426404和Z56771262对细胞生长的抑制效果甚至强于阳性对照SB366791。

化合物抑制热应激下的SAFB颗粒形成

通过免疫细胞化学分析，证实了Z19024498、Z220426404和Z56771262能抑制SAFB颗粒的形成，但不影响HSF1颗粒的形成。这些化合物既能抑制独立的SAFB颗粒，也能抑制与HSF1颗粒共定位的SAFB颗粒。Z224851224虽不影响独立的HSF1或SAFB颗粒形成，但能抑制与HSF1颗粒共定位的SAFB颗粒。

四种化合物不影响热应激诱导的细胞内Ca²⁺水平升高和Sat III RNA表达

为探究化合物抑制SAFB颗粒形成的机制，研究检测了多个相关参数。结果表明，四种化合物均不影响HSF1颗粒形成。Western blot分析显示，化合物处理不改变SAFB蛋白表达水平。细胞内Ca²⁺水平测量发现，化合物并不影响热应激诱导的Ca²⁺水平升高比例。此外，实时PCR结果显示，化合物处理也未影响热应激诱导的卫星III非编码RNA（Sat III RNA）表达升高。这些证据表明，这四种化合物通过不同于SB366791和2,5-HD的机制抑制SAFB颗粒形成。

确定对独立SAFB颗粒及与HSF1共定位颗粒的半抑制浓度（IC₅₀）

通过浓度依赖性实验测定了四种化合物对独立SAFB颗粒及与HSF1颗粒共定位的SAFB颗粒的IC₅₀值。结果显示，Z56771262对独立SAFB颗粒的IC₅₀值最低（6.2 μM），Z224851224对共定位SAFB颗粒的IC₅₀值最低（1.9 μM）。这些化合物对独立HSF1颗粒的抑制效果微弱，未计算出IC₅₀值。

确定四种化合物的半生长抑制浓度（GI₅₀）和热增强比（TER）

在五种细胞系（HeLa、H1299、AsPC1、HepG2、HEK293T）中测定了化合物在正常条件与热应激条件下的GI₅₀值，并计算了TER值（37°C GI₅₀/ 43°C GI₅₀）。Z19024498在所有五种细胞系中的TER值均大于1.0，表明其能普遍增强热效应。Z224851224和Z220426404在多数细胞系中也显示出TER > 1.0。所有TER > 1.0的结果均表明这些化合物具有热增敏效应。

四种化合物增强热应激诱导的凋亡效率

使用NucView488 caspase-3底物和PI检测凋亡细胞。结果显示，在五种细胞系中，Z19024498、Z224851224和Z220426404均能增强热应激诱导的凋亡效率，其效果与已知的热增敏剂5-FU和顺铂相当或更优。Z56771262在所有细胞系中诱导的凋亡均强于5-FU和顺铂，但在HeLa和H1299细胞中并未表现出相对于常温的显著增强。

Z56771262诱导细胞周期停滞

流式细胞术分析细胞周期发现，Z19024498、Z224851224和Z220426404对细胞周期进程无显著影响。而Z56771262则诱导了G₂/M期停滞，这表明其抑制细胞生长的机制是通过阻滞细胞周期。

Z19024498联合热疗有效抑制肿瘤生长

基于细胞水平的数据，选择Z19024498进行体内研究。在荷HeLa细胞的人源异种移植小鼠模型中，评估了Z19024498联合热疗的效果。与单独使用DMSO、单独使用Z19024498或单独热疗相比，Z19024498与热疗联合治疗显著抑制了肿瘤生长，并略微延长了小鼠的生存期，且未引起明显的生理毒性。

命中化合物的靶蛋白预测

利用多个靶点预测数据库对四种命中化合物的潜在靶蛋白进行预测。结果显示，未获得Z19024498和Z56771262的高置信度靶点候选。Z224851224的预测靶点为小眼畸形相关转录因子（MITF），Z220426404的预测靶点为血管内皮生长因子受体（VEGFR），但它们与热应激下细胞死亡的关系尚不明确，需进一步研究。

讨论与结论

本研究成功鉴定了四种能抑制独立及与HSF1共定位的SAFB颗粒形成的新型化合物。这些化合物能增强热应激诱导的凋亡效率。其中，Z19024498在体内与热疗联用展现出协同抗肿瘤效果，具有作为热增敏剂的潜力。然而，联合治疗后约第22天出现的部分肿瘤再生现象提示，未来需要优化给药条件（如浓度、给药次数）或开发靶向递送系统以提高疗效。

化合物的药物敏感性和TER值存在细胞类型依赖性，这可能与不同细胞系中ABC转运蛋白（如ABCB1）的表达差异有关。Z19024498的凋亡诱导效率在部分细胞类型中与顺铂相当或更高，但其广谱性有待通过后续的结构优化来提升。

Z56771262通过诱导G₂/M期停滞抑制细胞生长，并在非癌性HEK293T细胞中也显示出较强的凋亡诱导能力，提示可能存在意外副作用。而Z19024498、Z224851224和Z220426404虽不诱导凋亡或细胞周期阻滞，但仍能抑制细胞增殖，可能通过延长细胞倍增时间发挥作用，其机制或许与抑制翻译调控信号通路（如PI3K/Akt/mTOR）有关。

这些化合物抑制SAFB颗粒形成并增强热诱导凋亡的具体机制仍未完全阐明。由于SAFB参与mRNA剪接调控，SAFB颗粒的形成可能影响热应激下的剪接过程，从而调控凋亡。未来对其靶点的鉴定以及SAFB颗粒动力学如何调控凋亡机制的深入研究，将有助于开发更有效的先导化合物，并推动其与现有热增敏剂（如顺铂、5-FU）的疗效比较及潜在的临床转化。