(N)-甲烷碳桥腺苷衍生物作为P-糖蛋白与ABCG2转运蛋白的双重调节剂：一种对抗多药耐药肿瘤的新型刚性核苷支架

《Journal of Medicinal Chemistry》：(N)-Methanocarba Adenosine Derivatives as Dual Modulators of P-Glycoprotein and ABCG2 Transporters

本文综述了(N)-甲烷碳桥腺苷衍生物作为P-糖蛋白(P-gp)和ABCG2双重调节剂的发现与作用机制。针对肿瘤多药耐药(MDR)这一重大临床挑战，研究团队合成了34种核苷类似物，通过结构-活性关系(SAR)分析及ATP酶活性与转运功能测试，成功鉴定出化合物16(MRS8288)为双靶点抑制剂，并发现化合物30和40在ABCG2上分别表现出强效抑制与刺激活性。分子对接揭示了其不同作用模式的分子基础，为设计新型MDR逆转剂、克服癌症化疗耐药提供了重要线索。

　　

引言：克服肿瘤多药耐药性的挑战

化疗是癌症治疗的重要手段，但肿瘤细胞经常发展出多药耐药性(MDR)，导致治疗失败。ATP结合盒(ABC)转运蛋白，特别是P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)和ABCG2，是介导MDR的关键蛋白。它们利用ATP水解释放的能量，将多种化疗药物泵出细胞，降低细胞内药物浓度。尽管人们针对这些转运蛋白抑制剂进行了大量研究，但由于其在正常组织中也广泛表达，抑制剂的开发面临毒性挑战，目前尚无药物获批用于临床。因此，寻找新型、高效、低毒的ABC转运蛋白抑制剂具有重要的临床意义。

研究成果概述：新型(N)-甲烷碳桥核苷类似物的发现

本研究基于早期发现——延长N⁶的(N)-甲烷碳桥腺苷衍生物可调节肿瘤多药耐药相关的外排泵活性，合成了34种核苷类似物。通过系统评价它们对P-gp和ABCG2 ATP酶活性的影响，研究人员发现间位取代的N⁶-苄基衍生物16 (MRS8288)能够抑制两种转运蛋白的ATP酶活性，其IC₅₀值分别为1.4 μM和1.0 μM，展现出作为双重抑制剂的潜力。此外，对位取代N⁶-苄基的化合物30 (MRS8431)对ABCG2 ATP酶表现出强效抑制(IC₅₀为160 ± 9 nM)，而同分异构体、间位取代N⁶-苯基的化合物40 (MRS8432)则能强力刺激ABCG2的ATP酶活性(EC₅₀为7.5 ± 2 nM)。这三个关键化合物，尤其是16、30和40，还能抑制ABCG2介导的底物转运，但对P-gp的活性影响甚微，且自身并非ABCG2的转运底物。值得注意的是，化合物30能够显著使表达ABCG2的HEK-293-R5细胞对化疗药物米托蒽醌敏感化，而16和40则不具备此效应。

化学合成与结构-活性关系分析

为了探索以化合物9 (MRS7323)为先导结构的构效关系(SAR)，研究团队通过选择性功能化N⁶或C2位点，合成了这批(N)-甲烷碳桥核苷衍生物。合成路线（Scheme 1）包括各种炔烃与叠氮化物的点击化学反应等。通过ATP酶活性筛选发现，大多数核苷对ABCG2表现出比对P-gp更高的亲和力及调节倾向（抑制或刺激）。在测试的34个化合物中，有20个抑制ABCG2 ATP酶活性，9个刺激其活性，而对P-gp产生显著影响的化合物较少。只有化合物16能完全抑制P-gp和ABCG2两者的ATP水解。有趣的是，虽然许多化合物在C2位保留了先前确定的关键增效基团——3,4-二氟苯乙炔基，但16模板衍生的30和40却对ABCG2产生了截然相反的作用：抑制与刺激。SAR分析表明，N⁶取代基的类型（苄基或苯基）、连接基团（有无-CH₂-间隔基）、末端芳基的取代位置（对位或间位）以及5'端修饰（甲酰胺优于酯）都显著影响活性。

对转运功能的影响

选择高亲和力的七种化合物(16, 23, 30, 39, 40, 46, 47)进一步评估其对P-gp和ABCG2底物转运的影响。结果表明，这些化合物对P-gp介导的底物转运（如BD-维拉帕米）仅有微弱到中等程度的抑制（最高达58.2%）。然而，除23外，其余化合物均能有效抑制ABCG2对米托蒽醌和脱镁叶绿酸a的转运。例如，化合物30对两种底物转运的IC₅₀分别为0.50 ± 0.06 μM和0.88 ± 0.2 μM，显示出强大的抑制能力。尽管化合物40能强力刺激ABCG2的ATP酶活性，但它对底物转运仅产生部分抑制。这些结果凸显了(N)-甲烷碳桥核苷主要作用于ABCG2，对其底物外排功能有显著影响。

细胞毒性研究与逆转耐药效应

关键化合物16、30和40的细胞毒性实验表明，它们自身均不是ABCG2的转运底物，因为在表达ABCG2的细胞和对照细胞中，其细胞毒性曲线基本重叠。特别重要的是，在非毒性浓度下，化合物30能显著降低ABCG2过表达细胞对米托蒽醌的耐药倍数（从21.8倍降至1.45倍），表明其能有效逆转由ABCG2介导的化疗耐药。而化合物16和40的逆转效果则相对有限。

分子对接分析揭示作用机制

为阐明化合物30（抑制剂）和40（刺激剂）对ABCG2产生相反作用的分子基础，研究团队采用了分子对接模拟。他们选择了处于ATP水解周转状态下的ABCG2冷冻电镜结构（PDB: 7OJH, 7OJ8, 7OJI）进行深入研究。结果显示，在周转状态2（如PDB: 7OJ8）和E211Q突变体（PDB: 6HCO）结构中，化合物30的N⁶取代基上的对氯苯基呈现一种独特的延伸构象，指向由跨膜螺旋TM1和TM2形成的口袋，并与残基T402形成潜在的卤键相互作用。这种延伸构象可能阻碍了跨膜结构域与核苷酸结合结构域(NBDs)之间的偶联机制，从而抑制ATP酶活性。相反，化合物40以及已知的ABCG2底物（如雌酮-3-硫酸盐、米托蒽醌、拓扑替康）则保持一种自身折叠的结合模式，主要与TM2、TM5、TM2‘和TM5’形成的口袋相互作用，通过π-π堆积和卤键稳定结合，这种模式可能与ATP酶活性的刺激相关。结合亲和力计算也预测化合物30对ABCG2的结合亲和力高于40，这与其实验观察到的更强抑制活性一致。

讨论与结论

本研究系统阐述了(N)-甲烷碳桥腺苷-5'-甲酰胺衍生物通过延伸其N⁶取代基，能够差异性地调控ABCG2和P-gp的功能。核糖被空间受限的(N)-甲烷碳桥环替代是实现有效调节的关键。其中，具有间位取代N⁶-苄基的化合物16被鉴定为一种针对P-gp和ABCG2的双重微摩尔级抑制剂。而最具潜力的ABCG2抑制剂是对氯苯基衍生物30，它能高效抑制ABCG2的ATP酶活性与底物转运，并能有效逆转细胞对米托蒽醌的耐药性。结构同分异构体40则成为最强效的ABCG2 ATP酶刺激剂。分子建模预测，化合物30和40与ABCG2的结合模式存在显著差异，这解释了其功能上的对立：30通过独特的延伸构象可能干扰跨膜结构域-核苷酸结合结构域的偶联，从而抑制转运循环；而40则像已知底物一样，结合后促进ATP水解。

综上所述，这项研究不仅发现了一系列基于刚性核苷支架的新型MDR调节剂，其活性涵盖从抑制到刺激的广阔范围，而且通过对化合物30和40的深入分析，揭示了配体细微的结构差异如何通过影响其与转运蛋白结合口袋的相互作用模式，最终决定其对ATP酶功能的调控方向（抑制或刺激）。这些发现为基于结构的合理设计下一代ABC转运蛋白抑制剂、克服癌症化疗中的多药耐药性提供了重要的分子见解和先导化合物。