《Chinese Medical Journal》：Single-cell transcriptomics reveals the landscape of immune phenotypes in pituitary neuroendocrine tumors
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本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对22例垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）样本的免疫微环境进行深入解析，揭示了PIT1、TPIT和SF1三种主要肿瘤谱系间显著的免疫细胞组成异质性。研究发现PIT1谱系肿瘤中调节性T细胞（Treg）和滤泡辅助T细胞（Tfh）以及产生胶原的癌症相关成纤维细胞（CAF3）亚群显著富集；同时鉴定出Treg细胞与巨噬细胞/小胶质细胞之间通过CTLA4–CD86通路介导的新型免疫抑制性相互作用。这些发现为理解PitNETs的免疫调控机制提供了新视角，并为针对肿瘤微环境（TME）的个体化免疫治疗策略开发提供了潜在靶点。
垂体神经内分泌肿瘤的单细胞转录组景观
为解析垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）中肿瘤浸润免疫细胞的组成与功能，研究对来自北京天坛医院的22例PitNETs新鲜样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。样本根据关键转录因子（PIT1、SF1和TPIT）的表达分为不同谱系。经过严格质控，共获得287,051个单细胞用于后续分析。通过降维和细胞注释，在肿瘤微环境（TME）中鉴定出13种主要细胞类型，包括上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、小胶质细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞、成纤维细胞等。细胞比例分析显示，不同PitNET谱系间存在显著的免疫细胞分布差异，例如PIT1谱系肿瘤中富含T细胞和NK细胞，而SF1谱系中巨噬细胞、小胶质细胞和成纤维细胞比例较高，TPIT谱系则富含中性粒细胞。这初步揭示了PitNETs免疫微环境的谱系特异性。
PitNETs中上皮细胞的表征
研究在四种PitNET谱系中识别出五种上皮细胞类型，包括肿瘤细胞、干细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促性腺激素细胞和前PIT1细胞。其中肿瘤细胞在所有谱系中均占主导。拷贝数变异（CNV）分析显示，促性腺激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞具有更高的CNV水平，提示其恶性潜能更强。代谢分析揭示了不同上皮细胞类型的代谢异质性：肿瘤细胞富集于脂肪酸代谢和柠檬酸循环，干细胞则与谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和醛糖酸代谢途径相关。这些发现表明，PitNETs中不同的上皮细胞类型在组成和代谢活动上均存在显著异质性。
PitNETs中癌症相关成纤维细胞（CAFs）的异质性
研究共鉴定出五个CAF亚群，其分布具有谱系依赖性。其中，CAF3亚群在PIT1谱系中显著富集，而CAF5亚群则主要存在于TPIT谱系中。基因表达分析显示，CAF3高表达与胶原相关的基因（如COL1A1、POSTN），而CAF5则高表达炎症相关基因（如CXCL8、IL6）。进一步的功能分析表明，CAF3与细胞外基质（ECM）受体相互作用、蛋白质加工和粘着斑等通路相关，参与了有利于肿瘤发生和转移的微环境构建。相反，CAF5则富集于TNF信号通路、脂质代谢和动脉粥样硬化以及IL-17信号通路。基因集变异分析（GSVA）进一步证实，CAF3与上皮-间质转化（EMT）、糖酵解等过程相关，而CAF5则与炎症反应、TNFα-NF-κB信号和MYC靶通路相关。此外，scMetabolism分析显示CAF3积极参与多种氨基酸和糖胺聚糖的代谢途径，提示其可能与内分泌异常易感性有关。
PitNETs中髓系细胞的特征
对髓系区室（不包括中性粒细胞和肥大细胞）的分析揭示了七个表型不同的单核吞噬细胞（MP）群体，包括增殖性MP、巨噬细胞、单核细胞、常规树突状细胞1型（cDC1）、常规树突状细胞2型（cDC2）、小胶质细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。单核细胞和树突状细胞主要定位于PIT1谱系肿瘤，而小胶质细胞在SF1和混合谱系中比例更高。代谢活性分析显示，巨噬细胞和小胶质细胞具有较高的代谢活性。对小胶质细胞的谱系间比较发现，相较于SF1谱系，PIT1和TPIT谱系的小胶质细胞高表达与微胶质/巨噬细胞反应相关的CX3CR1和BHLHE41，并参与了中性粒细胞激活和干扰素-γ反应等过程。RNA速度分析推断出巨噬细胞的发育轨迹，揭示了Macrophages_C1QB作为共同祖细胞，可分化成Macrophages_CXCL3和Microglial cells_CX3CR1。在向Microglial cells_CX3CR1分化过程中，IL6ST、NFKBIA和TRA2B的mRNA水平升高。
PitNETs中中性粒细胞的异质性
研究识别了八个转录组学上不同的中性粒细胞亚群，它们在PitNETs谱系间分布各异。其中，表达分泌型磷蛋白1（SPP1）的中性粒细胞亚群在PIT1谱系中占主导，而表达抗菌肽（CAMP）的中性粒细胞亚群则在TPIT谱系中富集。功能富集分析显示，IL1B、SPP1、CAMP和S100A12中性粒细胞亚群与白细胞活化、体液免疫反应和炎症反应的调控显著相关。整合脑肿瘤数据集（低级别胶质瘤和胶质母细胞瘤）进行的生存分析表明，SPP1和CAMP的高表达与患者总生存期（OS）显著缩短相关。相关性分析进一步揭示，SPP1+中性粒细胞亚群与小胶质细胞和Treg细胞均呈强相关性，而CAMP+亚群主要与小胶质细胞强相关。
PitNETs中肿瘤浸润T细胞的多样性
研究在PitNETs中鉴定出13个T细胞亚群，包括增殖性T细胞、初始T细胞、T滤泡辅助细胞（Tfh）、调节性T细胞（Treg）和效应CD8+T细胞等。CD4+T细胞亚群在不同谱系中分布模式各异，其中Treg和Tfh细胞在PIT1谱系中显著富集。这一发现在流式细胞术和多重免疫组化（mIHC）实验中得到了验证。单细胞基因集变异分析（scGSVA）显示，Treg细胞在胆汁酸代谢和IL-6/JAK/STAT3信号通路中显著富集，而Tfh和增殖性T细胞则富集于脂肪酸代谢、顶端连接和p53信号通路。代谢途径活性分析表明，增殖性T细胞的代谢活性普遍较高，Treg细胞积极参与精氨酸和脯氨酸代谢，而Tfh细胞则参与鞘糖脂生物合成以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。+ FOXP3+Treg cells and CD4+ICOS+Tfh cells in different lineage tumors.">
PitNETs肿瘤微环境内的细胞间相互作用
鉴于TME固有的异质性，研究使用CellPhoneDB系统解析了转录定义的细胞亚群间的细胞通讯网络。配体-受体分析揭示了单核吞噬细胞（MPs）与CD4+T细胞亚群（特别是Treg和Tfh细胞）之间存在优先的相互作用。进一步分析发现，Treg和Tfh细胞主要通过CTLA4–CD86或CD28–CD86通路与单核细胞、巨噬细胞或小胶质细胞相互作用。此外，Treg和Tfh细胞也通过T细胞免疫受体含Ig和ITIM结构域（TIGIT）-NECTIN2通路与CAF3相互作用。随后的mIHC染色在PIT1谱系肿瘤组织中证实了CD68+巨噬细胞/小胶质细胞与FOXP3+Treg细胞在空间上的共定位，以及POSTN+CAFs与ICOS+Tfh细胞的关联。为了从机制上验证CTLA4–CD86通路在富含Treg的PitNET微环境中的调节作用，研究进行了CD86+巨噬细胞与初始CD4+T细胞的体外共培养实验。流式细胞术结果显示，使用抗CD86中和抗体处理后，由CD86+巨噬细胞介导的Treg分化被显著抑制。这一功能学证据表明，巨噬细胞来源的CD86通过与淋巴细胞上的CTLA4结合，驱动了Treg极化，从而确立了CD86在免疫抑制网络中的关键节点作用。
总结与展望
本研究通过对PitNETs进行全面的单细胞转录组分析，深入描绘了其肿瘤浸润免疫细胞的图谱，重点聚焦于免疫异质性和细胞间通讯网络。研究发现，三种主要PitNET谱系表现出不同的免疫细胞频率，其中PIT1谱系显著富集Treg和Tfh细胞以及产生胶原的CAF3亚群。更重要的是，研究鉴定出Treg细胞与巨噬细胞/小胶质细胞之间由CTLA4–CD86通路介导的新型免疫抑制性相互作用，并验证了其在肿瘤微环境（TME）中的潜在调控作用。这些发现深化了对PitNETs免疫复杂性的理解，并为开发针对TME的新型治疗策略和免疫疗法研究提供了重要的转化见解。尽管本研究存在样本量有限、缺乏正常对照等局限性，但它为未来开展更大规模的研究以及探索针对特定免疫亚群或信号通路（如CTLA4–CD86轴）的个性化免疫治疗奠定了坚实的基础。
