《Chinese Medical Journal》：Untargeted metabolomics based on LC-MS and GC-MS reveal metabolic reprogramming and putative biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis
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这项研究通过整合液相色谱-质谱（LC-MS）与气相色谱-质谱（GC-MS）平台，对包含399名参与者（涵盖肌萎缩侧索硬化症患者、健康对照及神经系统疾病对照）的两个独立队列血浆样本进行非靶向代谢组学分析。研究发现，肌萎缩侧索硬化症存在显著的氨基酸、脂肪酸和嘌呤代谢紊乱，其中次黄嘌呤（hypoxanthine）和肌苷（inosine）失调最为关键。研究进一步构建了由次黄嘌呤、肌苷和葫芦巴碱（trigonelline）组成的生物标志物组合模型，该模型在区分肌萎缩侧索硬化症与对照组时展现出卓越的诊断性能，曲线下面积（AUC）在队列1中达0.982，在队列2中达0.934。该研究结果为理解肌萎缩侧索硬化症发病机制及改善其诊断策略提供了新的见解。
引言
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS），亦称“渐冻症”，是一种致命性神经退行性疾病，以上、下运动神经元的进行性变性为特征。其病因与发病机制尚不完全明确，且缺乏可靠的生化与影像诊断标志物，这极大地阻碍了疾病的早期诊断与干预。代谢组学作为一种新兴技术，能够全面表征生物样本中的小分子代谢物，近年来已被广泛应用于生物医学研究，用于发现疾病相关生物标志物和阐明发病新机制。
方法
本研究共纳入了来自四家合作医院的399份血浆样本，包括170名ALS患者、200名健康对照和29名神经系统疾病对照。样本基于招募时间和中心被分配至发现队列（队列1）和验证队列（队列2）。采用基于液相色谱-质谱和气相色谱-质谱的非靶向代谢组学方法进行分析。数据经过多元统计（如主成分分析、偏最小二乘判别分析）和单变量统计分析。差异代谢物的筛选标准为错误发现率校正后P值<0.05且变量重要性投影值>1。利用MetaboAnalyst等平台进行通路富集分析。通过二元逻辑回归构建生物标志物组合模型，并使用受试者工作特征曲线评估其诊断效能。
结果
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参与者与数据质量：两个队列中，ALS组与对照组在年龄、性别上均无显著差异。质量控制样本的紧密聚类表明数据具有稳健性和可重复性。最终通过LC-MS和GC-MS分别鉴定了382种和142种代谢物。
- 2.
ALS代谢特征的发现：在发现队列中，与健康对照相比，ALS患者血浆中存在126种（LC-MS平台）和41种（GC-MS平台）差异代谢物。氨基酸和脂肪酸构成了这些差异代谢物的主要部分。通路富集分析显示，氨基酸酰基-转移核糖核酸（aminoacyl-tRNA）生物合成以及多种氨基酸代谢通路受到显著扰动。值得注意的是，肌苷和次黄嘌呤处于相关网络的中心位置。
- 3.
ALS相关代谢特征的独立验证：在验证队列中，OPLS-DA模型同样显示ALS与健康对照之间存在明显的代谢差异。使用相同阈值，通过LC-MS和GC-MS分别验证了53种和30种显著差异代谢物。通路富集分析复现了队列1中的关键发现，特别是氨基酸酰基-tRNA生物合成和苯丙氨酸代谢通路。
- 4.
通过神经系统疾病对照验证特异性：与神经系统疾病对照相比，ALS患者同样表现出显著的代谢差异，差异代谢物仍以磷脂、脂肪酸和氨基酸为主。通路分析进一步表明，氨基酸酰基-tRNA生物合成和氨基酸失调在ALS发病机制中具有重要影响。
- 5.
ALS中失调的氨基酸代谢：整合分析表明，系统性氨基酸失调是ALS的一个主要代谢特征。能量相关氨基酸（如支链氨基酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸等）在ALS患者血浆中显著升高。氨基酸作为关键底物，参与能量代谢、葡萄糖利用、嘌呤循环，并最终影响三磷酸腺苷（ATP）的产生。
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判别模型的建立与验证：研究筛选出在两个队列中均表现一致变化的26种代谢物作为候选标志物。受试者工作特征曲线分析显示，次黄嘌呤、肌苷、木糖胺、葫芦巴碱和谷氨酸在队列1中具有最高的区分能力。通过二元逻辑回归，构建了由次黄嘌呤、肌苷和葫芦巴碱组成的生物标志物组合模型。该模型在区分ALS与对照时表现出优异的诊断性能：在队列1中曲线下面积为0.982（95%置信区间：0.968–0.997），灵敏度为0.970，特异度为0.940；在队列2中曲线下面积为0.934（95%置信区间：0.902–0.966），灵敏度为0.942，特异度为0.791。这三种代谢物在ALS患者血浆中的水平均显著升高，尤其是次黄嘌呤和肌苷。虽然组合模型表现出高曲线下面积，但其诊断性能并未显著优于次黄嘌呤单独使用，这凸显了次黄嘌呤作为ALS可靠生物标志物的价值。
讨论
本研究揭示了ALS中氨基酸酰基-tRNA生物合成和氨基酸代谢的显著紊乱，并以次黄嘌呤和肌苷为网络核心节点。营养恶化是ALS的一个关键特征，伴随葡萄糖稳态受损。循环氨基酸水平升高表明ALS中蛋白质分解加速，骨骼肌作为主要储备库，最终导致肌肉萎缩。氨基酸对于维持中枢神经系统稳态至关重要。氨基酸酰基-tRNA生物合成通路明显失调，该通路由氨基酸酰基-tRNA合成酶（ARSs）调控，ARS功能障碍可能与神经元变性有关。
ALS患者体内次黄嘌呤和肌苷的显著升高可能表明嘌呤周转的系统性失调。这两种代谢物是嘌呤分解代谢级联的中间产物。次黄嘌呤积累反映了异常的ATP耗竭，并可能表明肌肉中嘌呤分解异常。低尿酸水平与更高的ALS风险和更快进展相关，而线粒体功能障碍诱导的活性氧可能损害黄嘌呤氧化酶（XO）活性，从而减少尿酸，并进一步驱动次黄嘌呤/肌苷在ALS中积累。
在中枢神经系统中，升高的次黄嘌呤可能促进氧化应激反应，对小胶质细胞和星形胶质细胞产生毒性作用，并诱发神经炎症。同时，次黄嘌呤积累会损害三羧酸循环通量和线粒体氧化磷酸化，从而破坏线粒体生物能量学并触发细胞凋亡。过量的次黄嘌呤/肌苷可能进一步损害嘌呤补救途径，导致ATP/二磷酸腺苷失衡。
次黄嘌呤的强大诊断能力凸显了嘌呤失调在ALS中的关键作用，这与我们之前的研究发现一致，即嘌呤代谢失调（表现为嘌呤核苷酸分解代谢加速）是SOD1G93A小鼠的典型代谢改变。重要的是，嘌呤代谢失调是ALS发病机制中的早期事件，先于神经病理学改变，这进一步强调了次黄嘌呤和肌苷的重要性。
结论
本研究发现，氨基酸酰基-tRNA生物合成的失调以及氨基酸代谢的紊乱可能在ALS的进展中扮演关键角色。此外，我们强调了次黄嘌呤在ALS诊断和发病机制中的潜在重要意义。进一步阐明ALS中氨基酸酰基-tRNA生物合成和嘌呤代谢失调的精确分子机制，可能为治疗策略的开发提供有价值的见解。
