《Molecular and Cellular Biochemistry》：Optimization of RNP-CRISPR for high-efficiency gene editing in mouse intestinal organoids
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本研究针对传统方法在小鼠肠道类器官中进行CRISPR基因编辑时存在的效率低、细胞毒性高、编辑后分化不一致等问题，开发了一种基于核糖核蛋白（RNP）-CRISPR的电穿孔方法。该方法实现了超过90%的编辑效率，并成功构建了APC基因敲除类器官，其表现出Wnt通路过度激活的特征，为解决小鼠类器官研究中的关键技术瓶颈、构建可扩展的肠道疾病模型平台提供了高效方案。
肠道，这个蜿蜒在我们腹腔内的复杂器官，不仅是消化吸收的主力，也是多种严重疾病（如炎症性肠病和结直肠癌）的发生地。为了在实验室里更真实地研究这些疾病，科学家们开发出了肠道类器官技术。这些由肠道干细胞培育而成的三维迷你器官，能够高度模拟真实肠道的细胞多样性和组织结构，堪称“培养皿中的迷你肠道”，是研究肠道发育、稳态和疾病的理想模型。然而，要让这些类器官真正发挥其在疾病机制研究和个性化药物筛选方面的巨大潜力，一个关键前提是能够精确地对它们的基因组进行工程化改造，例如敲除特定的致病基因。
传统的基因编辑方法，如病毒转导或脂质体转染，在应用于这类三维培养的类器官时，常常面临效率低下、对细胞毒性大以及编辑后细胞分化能力不稳定等挑战。这些限制不仅延长了实验周期（通常需要数周时间进行克隆筛选），也制约了类器官在功能基因组学和疾病建模中的应用。因此，开发一种高效、低毒且能保持类器官功能的基因编辑方法，成为该领域亟待解决的技术瓶颈。
针对这一难题，研究人员在《Molecular and Cellular Biochemistry》上发表了一项研究，他们成功优化了一种基于核糖核蛋白（Ribonucleoprotein， RNP）与CRISPR/Cas9技术的电穿孔方法，并将其应用于小鼠肠道类器官，实现了超过90%的高效基因敲除，为相关研究提供了强大的工具。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，他们从C57BL/6J小鼠小肠中分离并培养了肠道类器官。其次，他们利用在线工具设计了靶向特定基因（如Kiss1和Apc）的单向导RNA（single-guide RNA， sgRNA），并组装成CRISPR/Cas9 RNP复合物。核心步骤是使用Lonza 4D-Nucleofector?电穿孔系统，将RNP复合物递送至类器官来源的单细胞中，并系统优化了电穿孔程序。最后，通过Sanger测序、下一代测序（Next-Generation Sequencing， NGS）、合成基因（Synthego）公司的ICE分析、蛋白质印迹（Western Blot）、定量实时聚合酶链式反应（Quantitative Real-Time PCR， qPCR）以及免疫组织化学等多种技术，对编辑效率、基因敲除效果、脱靶效应以及类器官的表型变化进行了全面的验证和分析。
研究结果
1. 优化电穿孔条件以实现小鼠肠道类器官的高效基因敲除
为了将CRISPR/Cas9 RNP高效递送至小鼠肠道类器官，研究人员系统性地优化了电穿孔参数。他们首先培养了富含干细胞群的类器官，并将其消化成单细胞悬液。随后，测试了十种不同的商业电穿孔程序。结果表明，使用EH-100、DS-138和DS-130等程序，能够对Kiss1基因实现超过90%的总体编辑效率，其中导致移码突变（即有效敲除）的比例高达84%至87%。通过这项优化，研究人员建立了以EH-100程序为核心的高效编辑流程。
2. 编辑后类器官的分化潜能和长期稳定性
为了评估基因编辑是否会损害类器官的功能，研究人员在编辑后将其置于正常培养基中培养。结果显示，编辑后的类器官能够形成与未编辑对照组相似的囊状干细胞团。更重要的是，当撤除培养基中的Wnt3a以诱导分化时，经过特定程序（如EH-100）编辑的类器官仍能再生出隐窝样结构，表明其分化能力得以保留。此外，从这些类器官中分离出的单克隆类器官，在连续传代三代后仍能稳定维持Kiss1基因的敲除状态。免疫组织化学分析进一步证实，编辑后的类器官持续表达多种关键的干细胞标志物（如Olfm4）和分化细胞标志物（如MUC2、Lysozyme等），证明了其多谱系分化潜能未受损害。
3. 生成APC缺陷类器官
研究人员将优化后的电穿孔流程应用于靶向结直肠癌中的关键肿瘤抑制基因——腺瘤性结肠息肉病（Adenomatous Polyposis Coli， APC）基因。他们设计了四条靶向Apc基因外显子1的sgRNA，其中sgAPC-4显示出最高的预测靶向得分。使用优化流程（EH-100程序）进行电穿孔后，所有sgRNA均实现了高编辑效率，特别是sgAPC-4达到了近完全的敲除效果（99%的插入缺失频率，94%的移码效率）。蛋白质印迹和qPCR分析分别在蛋白质和信使RNA（mRNA）水平确认了APC的成功敲除。脱靶分析显示，在预测的前10个潜在脱靶位点未检测到显著的编辑活性，证明了该方法的高靶向特异性。
4. APC敲除导致WNT通路激活
APC缺失的类器官表现出异常Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路激活的典型特征。与野生型类器官不同，Apc敲除（Apc-KO）类器官可以在不含R-spondin1的培养基中自主增殖，形成致密的球形结构。即使在撤除Wnt3a后，Apc-KO类器官仍能维持干细胞样状态超过14天，而野生型类器官则在72小时内迅速分化并退化。BrdU掺入实验显示，Apc-KO类器官中增殖细胞的比例显著高于对照组。免疫组织化学分析进一步揭示了Apc-KO类器官中细胞核内β-catenin的积累大幅增加，同时增殖标志物Ki67阳性的细胞也显著增多。这些发现共同表明，APC的缺失驱动了持续的Wnt信号传导和不受控制的增殖，重现了结直肠癌发生过程中的早期事件。
结论与讨论
本研究成功建立了一种针对小鼠肠道类器官的高效RNP-电穿孔基因编辑协议，解决了该领域长期存在的技术瓶颈。该方法的核心优势在于其极高的编辑效率（>90%）和低细胞毒性，不仅避免了繁琐耗时的克隆筛选步骤，更重要的是，能够完美保持编辑后类器官的增殖与多谱系分化能力，为获得清晰、明确的表型解读奠定了基础。
利用这一强大工具，研究人员成功构建了Apc基因敲除的小鼠肠道类器官模型。该模型精准地模拟了APC缺失所导致的Wnt/β-catenin信号通路组成型激活，表现为生长因子非依赖性生长、核β-catenin累积和细胞过度增殖，完整重现了结直肠癌发生的关键早期病理特征。这为在体外深入研究Wnt信号通路在肠道稳态和肿瘤发生中的作用机制提供了一个即时、可靠且可控的平台。
与传统的病毒转导或脂质体转染等方法相比，本研究的RNP-电穿孔策略具有编辑效率高、脱靶风险低、无基因组整合风险以及细胞毒性小等显著优点。值得注意的是，优化得到的小鼠类器官最佳电穿孔参数（EH-100）与已报道的人类类器官参数有所不同，这提示了物种间细胞生理特性的差异，也凸显了针对特定模型进行参数优化的必要性。
尽管小鼠类器官模型在遗传可操作性和均一性方面具有优势，但它们缺乏人类癌症的遗传复杂性和肿瘤微环境。因此，未来需要将本研究揭示的核心机制在更具临床相关性的人源患者衍生的类器官（Patient-Derived Organoid， PDO）体系中加以验证。展望未来，这一高效、可扩展的编辑平台有望应用于高通量药物筛选，以发现APC突变细胞的特异性弱点；同时，也可用于构建包含基质细胞或免疫细胞的共培养模型，以研究肿瘤微环境中的相互作用，加速从基础机制发现向临床前洞察的转化。
