《Discover Viruses》：Design and in silico validation of a novel multi-epitopes subunit vaccine candidate against Lassa virus using reverse vaccinology approach
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为应对拉沙病毒缺乏有效疫苗的挑战，研究人员运用反向疫苗学方法，靶向保守的L蛋白，设计了一种旨在激发强效细胞免疫反应（CD4+、CD8+T细胞）的多表位亚单位疫苗。该候选疫苗经计算预测具有良好的抗原性、非致敏性及与TLR4的稳定相互作用，为后续实验评估奠定了坚实基础。
在非洲西部，一种名为拉沙热的急性病毒性出血热，如同幽灵般在社区中徘徊。它由拉沙病毒（Lassa virus， LASV）引起，这是一种生物安全等级高达4级的危险病原体，意味着处理活病毒需要极其严苛的高防护实验室。拉沙热每年导致数万例感染和数千人死亡，尤其是在医疗资源匮乏的低收入和中等收入国家，其影响被严重低估。更令人担忧的是，对于这种致命的疾病，目前全球范围内尚无批准上市的可供使用的疫苗。
为什么研制拉沙病毒疫苗如此困难？传统疫苗研发依赖于对活病毒进行培养、减毒或灭活，这对于像LASV这样的高致病性病原体而言，不仅过程缓慢、成本高昂，而且充满安全风险。此外，拉沙病毒感染后的免疫反应本身也给疫苗设计带来了独特挑战。与许多其他病毒感染不同，在拉沙热中，能够直接中和病毒的中和抗体出现得非常晚，通常是在患者康复之后。相反，研究证实，生存下来的患者主要依赖的是强大的细胞介导免疫（cell-mediated immunity， CMI）反应，特别是由细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocytes， CTLs）来清除被病毒感染的细胞。因此，一个理想的拉沙热疫苗，其目标不应仅仅是诱导抗体，而更应侧重于激发强大且持久的T细胞免疫应答。
面对传统方法的局限和疾病的特殊免疫需求，研究人员转向了一种更为先进、安全的策略——反向疫苗学。这是一种基于计算机（in silico）的强大方法，它绕过了对活病毒的直接操作。研究者只需从数据库中获取病毒的基因组序列，即可利用生物信息学工具，在整个病毒蛋白质组中“挖掘”出能够引发有效免疫反应的片段（即表位）。这种方法大大加速了候选疫苗的发现过程。
在此背景下，一篇题为《运用反向疫苗学方法设计与计算验证新型抗拉沙病毒多表位亚单位疫苗》的研究论文发表在《Discover Viruses》期刊上。为了应对拉沙热疫苗短缺的紧急公共卫生需求，研究团队展开了一项雄心勃勃的计算设计工作。他们旨在开发一种新型的多表位亚单位疫苗，这种疫苗能够精确地“训练”人体的免疫系统，特别是T细胞，以有效对抗拉沙病毒感染。
为了开展这项研究，研究人员运用了一系列关键的生物信息学和计算生物学技术方法。研究始于从公共数据库（如NCBI）中检索拉沙病毒的基因组序列，并选择高度保守的L蛋白作为靶点进行表位挖掘。随后，他们利用一系列预测服务器（如BepiPred 2.0、NetMHCpan 4.1、NetMHCIIpan 4.0等）来预测B细胞表位（包括线性和构象表位）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL/MHC-I）表位和辅助T淋巴细胞（HTL/MHC-II）表位。预测出的表位经过严格的过滤标准（包括抗原性、非致敏性、非毒性、保守性和与人类蛋白无同源性）筛选。筛选出的优质表位通过特定的连接子（如AAY、GPGPG、KK）与一个N端佐剂（来自结核分枝杆菌的50S核糖体蛋白L7/L12）串联，构建成最终的嵌合疫苗蛋白。该构建体的理化性质（如分子量、等电点、疏水性）通过ExpASy ProtParam等工具进行评估。其三维结构模型通过同源建模生成并经过验证。研究者还通过分子对接（使用ClusPro 2.0）和分子动力学模拟（使用GROMACS）评估了疫苗与免疫关键受体Toll样受体4（TLR4）结合的稳定性和动态行为。最后，利用C-IMMSIM服务器进行了计算机免疫模拟，预测疫苗在人体内可能引发的免疫反应动态，并进行了人群覆盖分析以评估其潜在适用性。
研究结果如下：
3.1 鉴定出强效且保守的B细胞和T细胞表位
通过对LASV L蛋白的免疫信息学筛选，研究人员成功鉴定并筛选出一系列高抗原性、高免疫原性、且在拉沙病毒不同毒株间高度保守的B细胞和T细胞表位。这些表位包括能够被抗体识别的线性B细胞表位、能被MHC-I分子呈递并激活CD8+T细胞的CTL表位（9肽），以及能被MHC-II分子呈递并激活CD4+T细胞的HTL表位（15肽）。所有入选表位均被预测为非过敏原且与人类蛋白无显著同源性，确保了疫苗的安全性。
3.2 多表位疫苗构建体的设计与理化性质表征
将筛选出的表位与佐剂序列通过合适的连接子串联，构建了一个包含231个氨基酸的嵌合疫苗蛋白。对该构建体的理化性质分析显示，其分子量为24.38 kDa，理论等电点（pI）为11.82，表明其为强碱性蛋白。其亲水性总平均值（Grand Average of Hydropathicity， GRAVY）为-1.70，预示其具有高度亲水性，有利于溶解。然而，其不稳定性指数高达72.57，且脂肪族指数较低（18.10），预测该蛋白本身不稳定且不耐热，提示在后续开发中可能需要制剂优化（如添加稳定剂或冻干）来保证其稳定性。
3.3 预测的稳定性、表达及安全性
尽管存在稳定性挑战，但该构建体在可溶性表达方面被寄予期望，因其分子量适中且亲水性强。更重要的是，安全性预测结果非常有利：该疫苗被预测为具有高抗原性（VaxiJen评分0.385），并且是非过敏原。这为其作为候选疫苗奠定了良好的安全基础。
3.4 氨基酸富集分析
对疫苗构建体氨基酸组成的分析显示，其富含异亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸等氨基酸，而色氨酸、组氨酸和半胱氨酸等氨基酸则显著减少。这种组成模式有助于降低蛋白质聚集风险，支持其非致敏性和良好的溶解性特性。
3.5 分子对接与界面分析
分子对接模拟表明，设计的疫苗候选物能与先天性免疫的关键受体——Toll样受体4（TLR4）稳定结合。进一步的分子动力学模拟（长达100纳秒）证实，疫苗-TLR4复合物结构稳定，关键结合界面（如TLR4-Lys42与疫苗-Asp67之间形成的盐桥）在整个模拟过程中保持稳定，这表明疫苗能有效触发TLR4介导的免疫信号通路，启动有效的免疫应答。
3.6 计算机模拟免疫反应
使用C-IMMSIM服务器进行的免疫模拟预测了该疫苗能引发强大且持久的免疫反应。模拟显示，在三剂接种方案后，疫苗能有效激活B细胞，诱导其从产生IgM转换为产生高水平的IgG1和IgG2抗体，并形成记忆B细胞。更重要的是，疫苗强烈激活了CD4+和CD8+T细胞，并诱导产生以白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）为主的Th1型细胞因子谱，这对于控制像LASV这样的细胞内病毒至关重要。模拟还预测了持久的T细胞记忆反应，预示着可能提供长期保护。
3.7 疫苗构建体的功能注释
基因本体（Gene Ontology， GO）富集分析揭示了一个有趣的现象：该疫苗构建体与“基因表达调控”、“转录调控”、“核酸结合”等细胞核内功能显著相关。这暗示该疫苗蛋白可能不仅仅是一个简单的抗原，还可能具有内在的免疫调节或“自我佐剂”特性，能够通过与宿主细胞内的核酸或转录因子相互作用，主动调节免疫相关基因的表达，从而增强免疫应答。
研究结论与讨论：
本研究成功运用反向疫苗学策略，设计并计算验证了一种新型抗拉沙病毒多表位亚单位疫苗候选物。该疫苗设计理念先进，其核心在于主动针对拉沙病毒感染中起关键保护作用的细胞免疫（CMI）进行设计，而非模仿自然感染中迟缓的抗体反应。它通过整合来自保守L蛋白的多种B细胞和T细胞表位，旨在引发全面且特异的免疫应答。
计算结果令人鼓舞：该候选疫苗被预测为抗原性强、安全性高（非过敏原），并能与TLR4稳定结合以有效启动免疫。免疫模拟预测其能诱导强烈的Th1极化反应和持久的免疫记忆。特别值得注意的是，功能分析提示该构建体可能具有独特的自我佐剂潜能，这为设计更高效的疫苗提供了新思路。人群覆盖分析显示，该疫苗对西非地区人群（主要流行区）的预测覆盖率高达95.30%，甚至略高于全球覆盖率（92.10%），表明其设计对目标人群具有高度针对性。
当然，研究也客观指出了该候选疫苗面临的挑战，主要是预测的蛋白不稳定性，这需要在后续的制剂开发中通过添加稳定剂、冻干或定点突变等技术手段来解决。与目前处于临床试验阶段的基于病毒载体（如rVSVΔG-LASV-GPC）或核酸（如DNA疫苗）的其他候选疫苗平台相比，这种多表位亚单位疫苗策略提供了另一种具有潜在高安全性和精准免疫靶向性的选择。
总之，这项计算研究为对抗拉沙热这一重大公共卫生威胁提供了一个有前途的新疫苗候选物蓝图。虽然所有计算机预测都必须经过严格的体外和体内实验验证，但本研究为将这一候选物推进到临床前评估阶段提供了坚实的理论基础和明确的方向。它代表了利用现代计算生物学工具应对传统疫苗开发瓶颈的一次成功实践，为最终开发出安全有效的拉沙热疫苗、保护西非乃至全球高危人群迈出了关键一步。
