《International Journal of Legal Medicine》：Pitfalls in body fluid identification – age independent DNA methylation markers for vaginal secretions and menstrual blood in sexual assaults
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在性侵案件中，准确鉴定阴道分泌物或月经血对案件定性至关重要。为解决现有方法因受害者年龄或激素状态（如青春期前或绝经后）导致鉴定失败的问题，研究人员开展了基于DNA甲基化分析的研究。他们建立了新的阴道分泌标记V1和血液标记B6，将其整合至扩展的体液鉴定流程（eBFI workflow）中，使99%的阴道分泌样本得以准确识别，且不受女性年龄或激素状态影响。
在法医科学的领域中，一滴微小的体液痕迹，往往能成为还原案件真相的关键证据。尤其是在性侵犯案件中，确认现场发现的DNA是否来源于受害者的阴道分泌物或月经血，对于判断是否发生过性接触具有决定性意义。然而，长期以来，法医实践中面临着两大“鉴定陷阱”：其一，对于阴道分泌物和月经血，市场上缺乏可靠、简便的快速检测试剂；其二，更棘手的是，传统的基于特定生物标记（如DNA甲基化模式）的鉴定方法，其有效性似乎并非“放之四海而皆准”。例如，来自青春期前幼女或已绝经女性的阴道分泌样本，其DNA甲基化水平可能与常规育龄女性的标准范围存在显著偏差，导致现有方法在这些特殊人群样本鉴定上“失灵”。这是否意味着，那些涉及未成年幼女或年长女性的性侵案件，会因此失去一项有力的科学证据支撑？正是为了填平这些因受害者年龄和生理状态差异而形成的“证据鸿沟”，由H. Konrad等人领导的研究团队开展了一项深入探索。
这项研究旨在开发并验证一种不受女性年龄或激素状态影响的、更可靠的体液鉴定方法。研究者们将目光聚焦于表观遗传学中的DNA甲基化这一稳定标记。他们提出假设：必须找到新的、更普适的DNA甲基化标记（CpG位点），以补充和完善2023年已发表的体液鉴定流程。为此，他们系统性地收集并分析了453份来自不同年龄段和生理状态女性的体液样本，包括育龄女性、绝经后女性和未成年幼女的阴道分泌物等，最终构建了扩展的体液鉴定工作流程（eBFI workflow）。研究结果有力地支持了他们的设想，并成功解决了实践中的难题。相关成果已发表于法医学领域的权威期刊《International Journal of Legal Medicine》上。
为了开展此项研究，研究人员运用了几个核心技术方法：首先，他们通过亚硫酸氢盐转化技术处理样本DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而区分甲基化与未甲基化状态。其次，使用焦磷酸测序技术，对经过设计与验证的特异性CpG位点的甲基化百分比进行精确定量分析。关键的样本来源包括：381份成人样本（涵盖血液、唾液、精液、阴道分泌物、月经血、鼻腔分泌物和鼻血），以及72份来自性侵案件取证后经检方批准用于研究的未成年女性（包括21名10岁以下和20名11-14岁）的阴道分泌拭子，此外还特别收集了39份绝经后女性的阴道分泌样本。数据分析主要依据甲基化百分比，并通过设定阈值来判断体液类型。
结果与讨论
数据的可靠性
所有样本均按照统一流程处理，排除了提取方法的影响。仅使用DNA浓度不低于0.75 ng/μl的样本进行亚硫酸氢盐转化。所有样本的亚硫酸氢盐转化对照均为阴性，表明转化成功。样本均进行重复分析，偏差率最大为5%。
新的阴道标记物和血液标记物的建立与验证
针对新的血液标记B6，外周血样本的DNA甲基化百分比在2%至34%之间，平均值为7%，标准偏差为5%。所有其他分泌物的甲基化值在9%至88%之间。因此，可将鉴定血液的阈值设定为<9%（见附图1A）。在随后的验证研究中，10份血液样本全部被正确鉴定为阳性。为防止误判，需结合原有的血液标记B7和鼻腔分泌标记物的结果进行综合判断。
针对新的阴道分泌标记V1，阴道分泌物的DNA甲基化百分比在31%至83%之间，平均值为61%，标准偏差为13%。所有其他分泌物的甲基化值在2%至69%之间。因此，对于血液预检为阴性的样本，可将鉴定阴道分泌物的阈值设定为>30%（见附图1B）。若血液预检为阳性，则DNA可能来源于阴道分泌物或月经血，但这在性侵案件背景下均可证明阴道接触。
激素状态的问题
在常规案件中，一名80岁以上的女性疑似强奸受害者样本，其阴道分泌标记V2的甲基化百分比远低于已建立的标准值。一个小样本队列显示，绝经后女性的阴道拭子样本在V2检测中的甲基化结果显著低于以育龄女性为主的初始队列。这表明阴道分泌物的甲基化模式可能因激素状态（如绝经）而发生功能性改变，同样的问题也可能存在于性成熟前的女孩中。
研究人员将阴道分泌样本分为四个队列进行分析：10岁以下女孩、11-14岁女孩、18-60岁女性和60岁以上女性。结果显示：
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V1标记的甲基化百分比随年龄先增后减（见附图3A）。使用>30%的阈值，仅约53%的未成年女性样本和97%的成年女性样本可被鉴定为阴道分泌物。
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V2标记的甲基化百分比范围在纳入不同年龄段女性后变得更宽（见附图3B）。使用>25%的阈值，约84%的未成年女性样本和98%的成年女性样本可被鉴定为阴道分泌物。
这说明两种阴道标记物的甲基化水平均依赖于激素状态。这两种标记物位于HOX基因簇的表观遗传调控区域附近，而HOX基因（如HOXA10， HOXA11）对女性生育能力至关重要，这解释了其甲基化模式随年龄/激素状态变化的原因。
关键的是，结合使用V1和V2进行检测，可将未成年女性样本的正确识别率提升至91%，成年女性样本的正确识别率提升至99%。
在eBFI流程中分析来自女孩和年长女性的阴道分泌物
将四个不同队列的阴道分泌物用原有的BFI流程进行分析后，导致部分非阴道标记物的阈值需要调整：
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用于鉴定鼻血或鼻腔分泌物的标记NB21的阈值需降至<50%。
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原有的血液标记B7在部分情况下不再适用，因此新增了血液标记B6。
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用于鉴定月经血的标记MB4的阈值不受影响。
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用于鉴定唾液的标记SA4的阈值仅受一个异常值影响，结合预检结果可排除假阳性。
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用于鉴定鼻腔分泌物的标记N27SE，仅在所涉女性年龄为18-60岁时适用原有阈值，否则无法用于鉴定鼻腔分泌物；但其用于鉴定精液分泌物的阈值在所有情况下均保持不变。
结论与讨论
本研究通过在原有的BFI工作流程中增加两个新的标记物（阴道分泌标记V1和血液标记B6），显著提高了其鉴定能力。这种补充性的双标记策略，不仅提升了eBFI流程的效能，更实现了对阴道分泌物和血液的鉴定不受受害者激素状态或年龄限制的目标，这对于涉及未成年或年长受害者的性侵案件法医学鉴定具有里程碑式的意义。
研究也揭示了方法学的动态发展特性：纳入先前未测试的样本类型，会导致已建立阈值的调整。例如，针对鼻腔血液标记NB21和血液标记B7的阈值修订，以及对鼻腔分泌物标记N27SE适用范围的重新界定，都体现了方法验证需要不断覆盖更广泛人群的必要性。此外，研究中未包含15-17岁青春期女性的样本，未来补充这部分数据可能引发阈值的进一步变化。
研究者也客观指出了研究的局限性：真实的案件样本在采集方式和储存条件上缺乏标准化，这可能会影响甲基化数值。但本研究采用的样本采集和储存方式更贴近实际案件情况，在一定程度上反制了此问题。未来，通过分析更多种类的体液或组织样本，有望进一步提升eBFI流程的信息价值。
总而言之，这项研究成功地将法医体液鉴定的科学前沿推向了一个新的高度。它不再将受害者视为生理状态一致的“标准个体”，而是直面并解决了因年龄和激素变化带来的生物标记物异质性难题。所建立的扩展eBFI工作流程，以其更强的鲁棒性和更广的适用性，为司法公正提供了更为坚实可靠的技术支撑，尤其为保护弱势群体（如儿童和老年女性）的权益增添了有力的科学武器。
