《Neurogenetics》：Compound heterozygosity of a novel missense variant and exonic deletion in hypomyelinating leukodystrophy 15
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本研究为解决在隐性遗传白质营养不良中，当传统全外显子组测序仅检测到单个候选变异时如何明确诊断的问题，研究人员通过全基因组测序发现并验证了首个EPRS1基因外显子缺失，结合错义变异c.3430 C>G，明确了复合杂合致病性。该发现不仅拓宽了HLD15的突变和临床谱，也强调了结构变异分析在遗传诊断中的关键作用。
在我们的中枢神经系统中，有一种被称为“髓鞘”的重要结构，它像电线外层的绝缘皮一样包裹着神经纤维，确保神经信号能够高速、准确地传递。髓鞘的形成与维护一旦出现故障，就会导致一系列严重的神经系统疾病，统称为“白质脑病”。其中，由特定基因突变引起的髓鞘发育不良，被称为“低髓鞘化白质营养不良”（Hypomyelinating leukodystrophies， HLDs）。近年来，随着基因测序技术的进步，科学家们发现了一个与HLDs密切相关的基因家族——编码细胞质“氨基酸酰基-tRNA合成酶”的基因。这些酶是蛋白质合成的关键“质检员”，负责给对应的转运RNA（tRNA）装载正确的氨基酸。EPRS1基因编码的正是谷氨酰-脯氨酰-tRNA合成酶，其双等位基因致病性变异会导致一种特定亚型——HLD15。然而，以往报道的EPRS1致病变异多为点突变，关于基因大片缺失，尤其是涉及整个外显子缺失的报道，尚属空白。这为某些仅通过常规测序发现单个变异、却无法确诊的病例带来了诊断困境。发表在《Neurogenetics》上的这项研究，正是为了突破这一瓶颈，揭示了一个由新型错义变异与外显子缺失共同导致的复合杂合病例，不仅首次报道了EPRS1基因的外显子缺失，也展现了一种相对温和、成年发病的HLD15表型，极大地拓宽了我们对这种疾病的认识。
研究人员为开展此项研究，运用了多个关键技术方法。首先，对一名40岁女性患者及其父母进行了家系全外显子组测序（Whole-exome sequencing， WES），以筛查单核苷酸变异和小插入缺失。当WES仅发现一个候选杂合错义变异时，研究者进一步采用了全基因组测序（Whole-genome sequencing， WGS），并利用Manta等生信工具进行结构变异（Structural variant， SV）分析，从而成功检测到常规WES易遗漏的外显子缺失。随后，通过Sanger测序进行家系分离分析，确认了变异的亲本来源和复合杂合状态。在功能层面，研究团队从患者淋巴母细胞系提取RNA，进行逆转录PCR（RT-PCR），并结合Sanger测序，分析了缺失等位基因的剪接后果及其转录本是否经历了无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay， NMD），以评估变异的功能影响。
研究结果
病例描述与临床特征
研究描述了一名40岁女性患者，临床表现为轻度智力障碍、共济失调、肌张力障碍和构音障碍。其症状在32岁后逐渐显现并进展。脑部磁共振成像（MRI）显示广泛的脑白质萎缩，T2加权像上呈高信号，胼胝体变薄，符合低髓鞘化的影像学特征。这些发现提示了HLD的可能性。
遗传学分析发现单个错义变异
对患者进行的WES分析，在EPRS1基因的脯氨酰-tRNA合成酶（Prolyl-tRNA synthetase， ProRS）结构域中发现了一个杂合的新发错义变异c.3430 C>G（p.Leu1144Val）。该变异在公共数据库（如gnomAD）中频率为0，位于已知致病热点区域，且生物信息学预测为有害。家系分析证实该变异遗传自父亲。然而，未发现第二个可能的致病性变异。
全基因组测序揭示外显子缺失
为进一步寻找第二个等位基因的变异，研究人员对患者进行了WGS。SV分析揭示了一个杂合的220-bp缺失（NC_000001.11:g.220006124_220006343del），该缺失跨越了EPRS1基因的第15外显子（c.1743-30_1932del）。通过设计跨断点的PCR引物并进行Sanger测序，精确验证了缺失断点。家系分析表明，该缺失遗传自母亲。因此，患者从父亲那里继承了错义变异，从母亲那里继承了外显子缺失，构成了复合杂合状态。
功能研究证实缺失等位基因功能丧失
为探究该缺失的分子后果，研究者在患者淋巴母细胞系中进行了RT-PCR分析。结果显示，来自缺失等位基因的转录本发生了第15外显子跳跃，导致阅读框移位并产生提前终止密码子（p.Asn582Serfs*10）。进一步的等位基因特异性表达分析表明，携带提前终止密码子的转录本主要经历了NMD，导致来自父源错义等位基因的转录本在患者细胞中占据主导表达地位。这证实了缺失等位基因是一个功能丧失（loss-of-function）变异。
变异致病性分类
根据美国医学遗传学与基因组学学会/分子病理学协会（ACMG/AMP）指南，外显子缺失c.1743-30_1932del被归类为“可能致病”（满足PVS1、PM2标准），而错义变异c.3430 C>G也被归类为“可能致病”（满足PM1、PM2、PM3、PP3标准）。
研究结论与讨论
本研究首次报道了EPRS1基因中的外显子缺失，并与一个新发错义变异共同构成了HLD15的复合杂合致病基因型。这一发现具有多重重要意义。
首先，它极大地拓宽了HLD15的突变谱。以往报道的EPRS1致病变异多为错义变异，且主要集中在ProRS结构域。本研究中发现的缺失位于谷氨酰-tRNA合成酶（Glutamyl-tRNA synthetase， GluRS）结构域，并通过诱导外显子跳跃和NMD导致等位基因功能完全丧失，这为EPRS1相关疾病的致病机制增添了新的类型。
其次，该病例呈现了相对温和且成年发病的临床表型，这与以往报道的多数在儿童期起病、症状较重的HLD15患者有所不同。研究者推测，这种表型差异可能与残留的EPRS1酶活性水平有关。在本病例中，母源的缺失等位基因因NMD而沉默，患者体内的EPRS1功能主要由父源的错义等位基因（p.Leu1144Val）维持。该变异位于ProRS结构域，可能保留了部分残余活性，从而导致了较晚的发病年龄和较轻的临床症状。这一发现提示，EPRS1相关疾病的临床严重程度可能存在一个由基因型（变异类型、所在结构域）和残余酶活性共同决定的连续谱。
最后，本研究强调了在隐性遗传疾病诊断中，当常规WES仅发现单个杂合致病性变异时，进行后续结构变异分析（如WGS）的极端重要性。本研究初始的WES分析未能检出该外显子缺失，直到WGS才得以明确。尽管事后回顾WES数据时发现第15外显子的测序覆盖深度有所下降，但仅凭覆盖深度变化通常难以做出确定性的诊断。因此，对于临床高度怀疑但WES结果为阴性或仅发现单个变异的病例，WGS或针对性的拷贝数变异分析应被视为必要的补充诊断手段。
总之，这项研究不仅报告了HLD15的一种全新遗传病因，丰富了其基因型-表型关联，也为神经遗传疾病的精准诊断提供了重要的方法论启示，即需要结合多种基因组学技术，才能全面揭示疾病的遗传基础。
