《Journal of the American Heart Association》：Pharmacological and Genetic Targeting of Inflammatory Chemokine Receptors CCR1, CCR2, and CCR5 in Atherosclerosis: A Systematic Review and Meta‐Analysis of Preclinical Studies
研究背景
心血管疾病（CVD）是全球范围内发病和死亡的主要原因，而动脉粥样硬化是其最常见的病理基础。过去认为动脉粥样硬化是一种血管胆固醇被动积累的疾病，如今其多面性已被阐明，伴随的慢性炎症是驱动疾病从早期发生到斑块失稳进展的关键因素。一些关键的临床试验已成功证明，抗炎干预可以减少继发性心血管事件，特别是在存在残余炎症风险的患者亚群中。秋水仙碱是这些试验中评估的主要药物之一，最近已成为首个获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于心血管疾病的抗炎药物。
白细胞在血管壁的迁移和浸润是动脉粥样硬化斑块发生发展的关键步骤，主要由内皮细胞和免疫细胞之间的配体-受体相互作用（包括整合素、血管粘附分子和趋化因子）所协调。CCR1、CCR2、CCR3和CCR5（统称为炎症CC趋化因子受体，iCCR）在炎症过程中对髓系细胞的募集调节起着至关重要的作用，是类风湿性关节炎和动脉粥样硬化等炎症性疾病的潜在驱动因素。尽管有初步研究表明，在高心血管风险的HIV患者中抑制CCR5对动脉粥样硬化参数有一些有益效果，但目前仍缺乏以明确心血管终点为指标的iCCR拮抗剂大型随机临床试验。因此，在很大程度上仍需依赖通过遗传或药理学手段靶向受体的临床前研究。
iCCR在各种动脉粥样硬化动物模型中已被广泛研究，以期阐明其作用和作为治疗靶点的可行性。CCR2是第一个与动脉粥样硬化相关的iCCR，早期研究表明，在载脂蛋白E（ApoE）和低密度脂蛋白受体（Ldlr）缺陷小鼠中，Ccr2或Ccl2的种系缺失可减轻疾病进展。然而，CCR1和CCR5在实验性动脉粥样硬化中的确切作用尚不清楚，不同的研究报告了药理学抑制或遗传敲低这些受体的保护性、有害性或中性效果。造成这些差异的因素可能很多，包括使用的动物模型或品系、干预方式的选择、干预持续时间以及所检查的病变部位或阶段。
研究方法
本荟萃分析根据系统综述和荟萃分析优先报告条目（PRISMA）指南进行。研究方案已在PROSPERO注册。研究团队系统检索了PubMed/MEDLINE、Embase和Web of Science数据库（截至2023年9月），使用与在实验性动脉粥样硬化中评估CCR1、CCR2、CCR3和CCR5受体的遗传和/或药理学操作相关的医学主题词（MeSH）和关键词（限于标题和摘要）。检索限于英文发表的文章。
纳入标准包括：关于动脉粥样硬化和/或高脂血症小鼠模型的原始研究；任何针对CCR1、CCR2、CCR3或CCR5受体的药理学或遗传操作并与对照组进行比较的研究。主要结局是动脉粥样硬化病变面积、新生内膜面积或阳性脂质染色面积的定量分析（以百分比或数值表示），以及斑块易损性的成分指标，包括通过免疫组化确定的巨噬细胞和平滑肌细胞的丰度以及病变胶原含量。次要结局涉及干预对小鼠体重和血脂谱（包括总胆固醇和甘油三酯含量）的影响。
三位评审员独立筛选研究的标题和摘要，然后进行全文审查。四位评审员从纳入的文章中独立提取数据，记录信息包括第一作者、发表年份、实验组、对照组、每组动物数量、血管床、物种、基因型、性别、体重、年龄、饮食类型、剂量、给药时间、频率、途径、载体以及主要和次要结局。如果数据未在文本或表格中以数字形式描述，则使用PlotDigitizer从图表中提取。对于缺失数据，联系了作者。
使用实验室动物实验系统评价中心（SYRCLE）工具评估偏倚风险。该工具包含10个标准领域：随机序列生成、基线特征、分配隐藏、随机安置、干预盲法、随机结局评估、结局评估盲法、不完整的结局数据、选择性报告和其他偏倚来源。通过目视检查漏斗图评估发表偏倚。
所有统计分析均使用R软件进行。使用Hedges方法计算标准化均值差（SMD）及95%置信区间（CI）作为效应量，以考虑小样本量。采用DerSimonian和Laird随机效应模型来解释纳入研究的异质性，并使用Hartung和Knapp校正来考虑研究数量较少的情况。通过目视检查森林图以及使用Q检验、I2和τ2统计量来估计研究之间的异质性程度。还计算了95%预测区间，以提供未来研究的真实效应大小可能落入的范围。为了解释潜在的异质性来源，按血管部位、动物模型、饮食类型、饮食持续时间和性别进行了亚组分析。还通过排除被认为具有高偏倚风险的研究进行了敏感性分析。最后，通过生成漏斗图并使用Egger回归检验评估发表偏倚来评估小研究效应。
研究结果
研究选择与特征
系统检索共产生716篇文章，其中213篇被识别为重复。通过参考文献筛选和手动检索相关期刊，额外确定了2篇论文。随后，在筛选标题和摘要后，因各种原因排除了454条记录：161篇是综述、信件、社论、荟萃分析或会议摘要，293篇被认为与主题无关。经过初步筛选，51项研究被认为可能符合条件，并对其全文进行了评估。其中13项研究随后被排除：7项未报告相关结局或报告不清，3项未使用高脂血症或动脉粥样硬化实验模型，2项检查了其他非iCCR靶点或使用了不恰当的干预措施，1项未能纳入合适的对照组。最终，38篇文章被纳入系统综述，而主要荟萃分析在总共37篇文章上进行。
大多数研究使用了具有高脂血症和动脉粥样硬化遗传易感性的小鼠模型，并辅以高脂肪饮食喂养。其中大多数（29项）使用Apoe-/-小鼠，5项选择Ldlr-/-小鼠，1项使用ApoE3-Leiden小鼠。另有2项研究调查了喂食致动脉粥样硬化饮食的天然C57BL/6背景小鼠的早期动脉粥样硬化病变形成。13项研究使用了加速或增强的动脉粥样硬化模型。
在指定性别的研究中，大多数关注的结局是在雄性小鼠中报告的。8项研究未明确说明所用动物的性别。
21项研究依赖趋化因子受体的遗传（全身或造血）缺失。其中5项报告靶向Ccr1，13项干预Ccr2，7项干预Ccr5。14项研究依赖CCR的药理学阻断，治疗持续时间从3周到14周不等。其中7项研究使用抑制性化合物靶向CCR2。关于CCR5，2项研究选择了选择性CCR5拮抗剂马拉韦罗。van Wanrooij等人报告了在CCR5抑制背景下使用TAK-779，尽管它也显示可与CCR2结合。CCR5/CCR1的双重拮抗剂N-末端甲硫酰化的调节激活正常T细胞表达和分泌因子（Met-RANTES）在4项研究中使用。另有4项研究依赖转染编码单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）N末端缺失突变体（7-ND）的质粒，以抑制MCP-1/CCR2相互作用。
偏倚风险与发表偏倚
在所有纳入系统综述的研究中，只有6项报告了为每组充分生成随机序列，另有8项研究描述了动物的基线特征（包括年龄、性别和体重）。分配隐藏和随机安置领域在所有研究中报告不佳，因此被评定为不明确。除1项研究外，研究者对干预措施的盲法和随机结局评估同样被评定为不明确。此外，1项研究存在较高的检测偏倚风险，结局评估未在盲态条件下进行。在相当一部分纳入研究中检测到较高的损耗偏倚风险，这些研究未将所有实验动物纳入下游分析，且未提供明确的排除理由。虽然没有研究预先发布或包含研究方案，但所有预期结局均被报告，导致报告偏倚风险统一较低。此外，所有研究均被认为在其他偏倚来源方面风险较低。
对于发表偏倚，漏斗图的目视检查发现在评估受体靶向对CCR1、CCR2和CCR5病变面积影响的研究中存在不对称性。Egger检验显示，在针对CCR2和CCR5的研究中，对病变面积存在显著的小研究效应，但在CCR1的研究中不显著。由于可用研究数量较少，Egger检验不适用于巨噬细胞、平滑肌细胞和胶原含量。
趋化因子受体靶向对病变面积、斑块成分和稳定性的影响
荟萃分析表明，遗传靶向趋化因子受体CCR2或CCR5显著减小了所有血管床病变的平均面积（CCR2：SMD = -1.14 [95% CI，-1.47至-0.81]；CCR5：SMD = -1.06 [95% CI，-1.64至-0.48]），但对CCR1无此效应（CCR1：SMD = -0.14 [95% CI，-1.06至0.79]）。所有靶点的95%预测区间均包含零值，这表明干预效果在目前综合研究中可能无法在所有可比较的实验条件下一致地检测到。
然而，药理学干预在3种受体上均显著减小了病变面积（CCR1：SMD = -1.88 [95% CI，-2.84至-0.93]；CCR2：SMD = -0.72 [95% CI，-1.15至-0.29]；CCR5：SMD = -1.92 [95% CI，-2.58至-1.26]）。CCR1和CCR5的预测区间排除了零值，但CCR2的预测区间跨越零值，这表明在可比较的实验环境下，CCR2的药理学效应幅度可能不太一致。
单独靶向CCR2或CCR5均与病灶内巨噬细胞浸润的显著减少相关，无论是遗传方式（CCR2：SMD = -1.35 [95% CI，-1.97至-0.74]；CCR5：SMD = -1.29 [95% CI，-2.39至-0.20]）还是药理学方式（CCR2：SMD = -0.86 [95% CI，-1.43至-0.29]；CCR5：SMD = -1.69 [95% CI，-2.69至-0.69]）。只有CCR2的遗传靶向产生了始终低于零值的预测区间。抑制CCR1对巨噬细胞含量没有影响，与指定的干预方式无关。
抑制CCR1、CCR2或CCR5与斑块内平滑肌细胞或胶原含量的显著变化无关，尽管在CCR2抑制的情况下，胶原含量和平滑肌细胞有增加的趋势。虽然由于未报告标准误差值而未纳入荟萃分析，但Qui?ones等人还描述了在喂食正常饮食或高脂肪饮食的晚期动脉粥样硬化ApoE缺陷小鼠中，全身或造血缺失CCR5与病变面积减小相关，并且在喂食正常实验室饮食的Ccr5-/-动物中巨噬细胞积累减少。
进行的敏感性分析表明，排除被评为具有高偏倚风险的研究对CCR1和CCR5的效应量有低到中度影响，但并未改变结论。
进一步荟萃分析了iCCRs遗传或药理学抑制与定义的次要结局之间的关联：操作CCR1、CCR2和CCR5对小鼠体重的影响可忽略不计。操作CCR2影响了脂质代谢，药理学阻断降低了总胆固醇水平，遗传靶向降低了甘油三酯浓度。相反，遗传靶向CCR1显示总胆固醇水平升高。靶向CCR5不影响小鼠血脂谱。
基于干预、性别、血管床、模型、饮食类型和动脉粥样硬化阶段的亚组差异
为了解释大多数主要结局中观察到的中度至高度异质性，并揭示导致这些差异的可变因素，进行了一系列亚组分析。
靶向CCR2（而非CCR1或CCR5）对病变面积的影响根据评估的病变部位在亚组之间存在显著差异，其中在颈动脉观察到的减少幅度最大。
研究使用的动脉粥样硬化模型的差异与受体抑制对病变面积的汇总效应的变化无关，在ApoE-/-和Ldlr-/-小鼠中，CCR5抑制（其中跨模型的研臂数量相当）导致的斑块负荷减轻相似。
分析进一步揭示了CCR1（而非CCR2或CCR5）靶向对动脉粥样硬化负荷的结果受性别影响显著，仅在雄性小鼠中观察到病变面积的显著减小。同样，CCR5抑制相关的病灶巨噬细胞丰度减少也仅限于雄性。
在根据病灶血管床或使用的动脉粥样硬化模型对CCR1、CCR2和CCR5干预对巨噬细胞含量的影响方面，亚组之间未发现显著差异。
探讨动物所喂饮食类型对荟萃分析研究结局的影响，研究表明，在喂食西方饮食的小鼠中，与CCR2抑制相关的病变面积和巨噬细胞含量的减少幅度远大于喂食正常实验室饲料的小鼠，尽管后者未达到统计学显著性。相比之下，饮食成分的差异与CCR1或CCR5抑制对病变面积或巨噬细胞含量的影响的显著变化无关。
最后，检查了所评估疾病阶段的影响，将研究分为动物喂食西方饮食少于或多于12周，分别作为早期和更晚期动脉粥样硬化的替代指标。虽然CCR5的遗传或药理学抑制在两个病变发展阶段都显著减小了病变面积，但CCR1或CCR2抑制引起的病变面积减轻仅在疾病的早期阶段显著。同样，CCR5抑制相关的病灶巨噬细胞丰度减少也仅在疾病的早期阶段显著，尽管值得注意的是，报告CCR5靶向对晚期动脉粥样硬化巨噬细胞含量影响的研臂数量相对较少。
讨论
在这项系统综述和荟萃分析中，研究者调查了在总共38项实验性动脉粥样硬化研究中，通过遗传操作或受体拮抗作用靶向炎症CC趋化因子受体1、2和5对动脉粥样硬化负荷的影响，揭示了iCCR在动脉粥样硬化斑块形成中的相似性以及差异性。
研究发现，抑制CCR2和CCR5分别与病变面积的大幅减少相关，这种效应在多个血管床中均得以保持，且不依赖于干预方式的选择，并伴有斑块成分的有利变化，包括巨噬细胞丰度减少。与此形成对比的是，靶向CCR1仅在药理学干预的背景下，或者确实仅在考虑雄性群体时才显示出减轻病变面积的作用。
iCCR已被证明在髓系细胞（包括单核细胞和树突状细胞）向炎症部位的募集中发挥基础作用，因此代表了潜在的治疗靶点。在动脉粥样硬化背景下，关于每个iCCR对动脉粥样硬化发展的贡献程度仍存在争议。这项荟萃分析提供的证据表明，消融或拮抗CCR2和CCR5在实验性动脉粥样硬化中发挥保护作用。相比之下，CCR1抑制的影响不太明显，可能是环境依赖性的或被研究间的变异性所掩盖。尽管数量不多，但先前使用iCCR拮抗剂的临床试验已显示出通过积极改变心血管疾病风险指标的前景。
与后一项试验的报告一致，分析中注意到iCCR拮抗作用对血脂谱的影响有限，这表明iCCR抑制的抗动脉粥样硬化作用很可能是通过免疫调节介导的。研究结果强调了iCCR靶向药物作为精细治疗方案一部分的潜在效用，与传统的降脂疗法一起对抗相关患者亚群中存在的残余炎症风险。
iCCR可能偶尔在免疫细胞表面共表达，并且在配体结合方面表现出重叠，可能导致功能冗余。如果这是正确的，可能会限制靶向单个受体的功效，并且被认为是先前一系列慢性炎症疾病受体拮抗剂临床试验失败的关键原因。考虑到药理学药物潜在的脱靶效应，药理学抑制经常被观察到优于遗传缺失（特别是对于CCR1和CCR5）这一事实，可能为多重受体靶向的益处提供了论据。实际上，纳入研究中使用的几种药理学药物已知表现出多受体活性。最值得注意的是，Met-RANTES被报道可拮抗CCR1和CCR5，而TAK-779对CCR5和CXCR3具有很强的结合亲和力。荟萃分析中的一些研究也强调了趋化因子受体之间的补偿性相互作用。
据研究者所知，本研究是第一个调查靶向每个iCCR在实验性动脉粥样硬化中累积影响的系统综述和荟萃分析，并可能为未来临床试验的目标选择提供见解。然而，这项研究也存在局限性。首先，分析揭示了在大多数结局中，iCCR抑制的效果存在相当大的异质性，这可能会影响得出的效应估计。这反映在跨越零值的宽预测区间上，表明在未来研究中不能排除无效甚至负效应的可能性。虽然这些差异中的许多可能可以通过干预选择、病变形成部位、使用的动脉粥样硬化模型和所调查的疾病阶段来解释，但还有其他复杂因素，包括：1. 这些研究中使用的药理学拮抗剂在选择性、作用方式、剂量和给药途径上可能有很大差异；2. 抑制iCcr功能的遗传策略和相关效率。其次，进行的几项单独的亚组分析相对效力不足，这进一步使结果解释复杂化。
结论
来自汇总分析的临床前证据表明，多种趋化因子受体参与动脉粥样硬化形成，主要是通过调节动脉粥样硬化病变面积和病变内的巨噬细胞含量。在动脉粥样硬化背景下，抑制CCR2或CCR5具有保护作用，而靶向CCR1的相关效应尚不清楚，其在疾病早期阶段可能的有益效应需要进一步研究。未来的临床前研究应进行战略性设计，以纳入所有iCCR，增强对其在动脉粥样硬化病理中作用的理解。
