《Journal of the American Heart Association》：Empagliflozin Attenuates Global Cerebral Ischemic Injury After Cardiac Arrest Through Enhancing Ketone Body Oxidative Metabolism in Rats
编辑推荐：
本研究揭示了SGLT2抑制剂恩格列净(empagliflozin)在心脏骤停(CA)后全脑缺血损伤中的神经保护作用。研究通过大鼠CA模型，证实恩格列净可改善神经功能评分，提升存活率，并发现其通过上调血清和大脑中的β-羟基丁酸(BHB)水平，增强酮体氧化代谢，从而减轻神经炎症、保护海马突触超微结构、维持线粒体功能，最终发挥神经保护作用，为CA后脑损伤治疗提供了新策略。
背景与方法
心脏骤停(CA)是全球范围内导致死亡的主要原因，幸存者常伴有严重的神经功能缺损和认知障碍。目前包括目标温度管理在内的治疗策略效果有限。恩格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂，最初用于治疗2型糖尿病，但已有临床前研究表明其在多种缺血/再灌注损伤中具有器官保护作用。酮体，特别是β-羟基丁酸(BHB)，作为神经元在缺血条件下的替代能量底物，其神经保护作用日益受到关注。本研究旨在探讨恩格列净在大鼠CA诱导的全脑缺血模型中的神经保护特性，并验证其作用是否通过调节酮体代谢介导。研究假设恩格列净可能通过调节酮体代谢来减轻CA后的全脑缺血损伤。
研究使用206只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，通过心室颤动诱导CA模型，并进行心肺复苏(CPR)。动物随机分组，分别接受恩格列净、BHB或载体对照治疗。评估指标包括神经功能缺损评分(NDS)、组织病理学评估、Fluoro-Jade B(FJB)染色、免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹分析(Western blot)和线粒体复合物I活性测定。
结果
恩格列净改善CA后大鼠的神经功能结局和酮体水平
高剂量恩格列净(10 mg/kg)显著提高了CA后72小时内动物的生存时间，并有效改善了CA后24、48和72小时的神经功能缺损评分(NDS)。组织学检查（苏木精-伊红染色）显示，恩格列净给药显著逆转了CA诱导的脑部病理损伤。此外，恩格列净治疗在ROSC后的各个时间点均显著提高了血清和大脑中的BHB浓度。
恩格列净和BHB在CA后保护神经元免受损伤
FJB染色、尼氏染色和MAP2免疫荧光染色结果显示，CA诱导了海马CA1区神经元变性、尼氏体减少和神经元标志物MAP2表达下降。而恩格列净或外源性BHB补充治疗均能显著减少FJB阳性神经元，增加尼氏体和MAP2的染色，表明两者均能发挥神经保护作用，对抗全脑缺血/再灌注损伤。
恩格列净和BHB减少CA后的神经炎症
神经炎症在CA诱导的神经元损伤中起关键作用。免疫荧光染色显示，CA后大鼠脑中小胶质细胞（Iba1阳性）被激活，而恩格列净和BHB治疗均能显著减弱这种异常激活。此外，CA诱导了血清和大脑中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平的显著升高。恩格列净和BHB治疗有效抑制了这些促炎细胞因子的释放。
恩格列净和BHB改善CA后海马突触的超微结构
神经炎症和小胶质细胞在调节突触结构和功能中起关键作用。透射电镜检查发现，CA后72小时，海马突触数量显著减少，突触后密度(PSD)显著增厚。恩格列净和BHB治疗有效保留了突触数量，并逆转了PSD的增厚。此外，与学习记忆相关的多重突触扣结(MSBs)和穿孔突触的数量在CA后显著增加，而恩格列净和BHB治疗进一步增加了这两种突触的数量，表明它们对维持海马突触结构和功能的完整性至关重要。
恩格列净和BHB恢复CA后大脑线粒体能量代谢
线粒体在能量代谢中不可或缺，且与CA后脑损伤相关。透射电镜观察显示，CA组线粒体呈现碎片化或拉长形态，嵴密度降低，线粒体表面积减小。恩格列净和BHB治疗均能保护线粒体超微结构并增加线粒体表面积。此外，CA暴露导致三磷酸腺苷(ATP)合成显著减少、线粒体复合物I活性受损、血清乳酸水平升高以及大脑琥珀酸水平升高。恩格列净或BHB治疗增强了复合物I活性，降低了血清乳酸水平，并提高了大脑琥珀酸水平，从而恢复了线粒体能量供应。
恩格列净的神经保护功能依赖于酮体氧化代谢
鉴于BHB和恩格列净在CA后具有相似的神经保护作用，研究进一步探究了恩格列净的作用是否通过影响酮体代谢介导。使用匹莫齐特(pimozide)抑制酮体氧化的限速酶OXCT1（琥珀酰辅酶A:3-酮酸辅酶A转移酶1）的活性。结果发现，匹莫齐特减弱了恩格列净的神经保护作用，表现为大鼠生存时间缩短、神经功能评分(NDS)下降、脑内TNF-α和IL-1β水平升高、神经元损伤（MAP2染色减少）加剧、ATP产生减少以及脑琥珀酸水平降低。同时，匹莫齐特还下调了酮体氧化代谢中两个关键酶BDH1（β-羟基丁酸脱氢酶1）和OXCT1的表达。这些结果共同表明，恩格列净对CA后脑功能的保护作用依赖于酮体氧化代谢。
讨论
本研究阐述了大鼠CA诱导的全脑缺血模型中恩格列净的神经保护作用。主要发现是恩格列净治疗显著提高了CA后大鼠的存活率和神经功能结局，组织病理学分析也证实了海马CA1区神经元损伤的减少。恩格列净治疗后血清和脑BHB水平的显著升高，表明在缺血条件下神经元对酮体作为辅助能量底物的依赖性增强。鉴于酮体作为内源性神经保护剂在代谢应激期间支持细胞代谢和功能的作用日益得到认可，本研究进一步证明，恩格列净给药或外源性BHB补充均可减轻神经炎症（表现为小胶质细胞活化减少），并抑制循环系统和大脑中炎症细胞因子的释放。此外，恩格列净的有益作用在机制上与海马突触超微结构的调节以及线粒体结构完整性和代谢功能的保存密切相关。恩格列净的神经保护作用与其调节酮体氧化代谢有关，证据是酮体代谢中两个关键蛋白BDH1和OXCT1的上调。这项研究对于开发旨在改善CA患者预后及其后续脑损伤风险的药物干预具有重要意义。
酮体可以显著改变大脑代谢，生酮饮食或外源性酮体等方法可以增加血液中酮体浓度，潜在地改善神经退行性疾病中的能量危机。先前的研究已经确立了酮体的神经保护作用。本研究引入了一个新的视角，直接将恩格列净的神经保护作用与其对酮体代谢的影响联系起来。与之前主要关注恩格列净一般神经保护特性的研究不同，本研究专门探讨了BHB在CA诱导的脑损伤背景下的作用。琥珀酸是酮体在线粒体中通过OXCT1氧化的副产物。本研究发现，恩格列净或BHB不仅提高了琥珀酸水平，还调节了酮体代谢关键酶（如BDH1和OXCT1）的表达，从而更全面地理解了潜在的分子机制。此外，本研究通过CA模型评估恩格列净的神经保护作用，有别于其他主要关注孤立性脑缺血模型的研究。研究发现，通过抑制OXCT1活性来减少酮体氧化的化合物匹莫齐特，消除了恩格列净的保护作用。这支持了恩格列净通过调节酮体氧化代谢来减轻CA后全脑缺血损伤的概念。
神经炎症是缺血性损伤的关键反应，可加剧神经元损伤并导致CA后不良结局。恩格列净和BHB治疗在减轻炎症反应方面显示出有希望的效果。在本研究中，小胶质细胞活化减少以及炎症细胞因子（如TNF-α和IL-1β）水平降低表明了这些治疗的抗炎特性。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，在缺血条件下发挥双重作用。虽然它们对于清除碎片和死亡细胞至关重要，但其过度活化会导致促炎细胞因子的释放，进一步损害周围的神经元。本研究证明，恩格列净和BHB治疗显著降低了小胶质细胞活化标志物Iba1的表达，表明其对神经炎症反应有抑制作用。此外，治疗后TNF-α和IL-1β水平的降低尤其值得注意。核因子κB(NF-κB)是这些细胞因子的核心上游调节因子。据报道，恩格列净和BHB都可以抑制NF-κB的激活。NF-κB的激活已知会触发NLRP3炎性体活化。研究发现，恩格列净和BHB可以抑制NLRP3炎性体的活性。此外，一项研究表明恩格列净通过BHB抑制NLRP3炎性体活性。本研究在此基础上，为恩格列净在CA诱导的脑损伤背景下的抗炎作用提供了直接证据。
突触完整性是认知功能的基础，其保存对于CA后的恢复至关重要。本研究发现，恩格列净和BHB治疗维持了海马突触的超微结构，而这在缺血事件后常常受到损害。治疗后的突触扣结数量量化和保存完好的PSDs观察表明了对突触形态的保护作用。此外，已有报道称联想学习涉及导致MSB形成的特定突触发生，这可能是一种普遍的结构性突触可塑性形式。海马体，特别是CA1区，对缺血性损伤高度敏感，并与学习和记忆过程相关。先前的研究表明，延迟的CA1神经元死亡可能与缺血诱导的突触结构波动以及NR2B和GluR1亚基的上调有关。与本研究的发现类似，其他研究也发现酮体BHB可以作为葡萄糖的替代能量底物，并保持神经元完整性，尤其是在早期发育期间。本研究通过证明BHB对缺血性损伤后突触超微结构的直接影响（表现为穿孔突触和MSBs数量增加）与此一致。穿孔突触数量（其与突触可塑性和记忆形成有关）的增加进一步支持了恩格列净治疗的神经保护作用。
线粒体对于提供突触功能和可塑性所需的能量至关重要。此外，线粒体功能的恢复是神经保护的关键方面。在缺血/再灌注损伤期间，氧气和营养物质的相对缺乏会损害线粒体功能，导致ATP产生减少和活性氧增加，从而造成进一步的细胞损伤。本研究发现，恩格列净或BHB治疗显著恢复了线粒体超微结构和功能，表现为线粒体复合物I活性的保持、线粒体表面积的增加和ATP合成的增强。这与先前强调酮体在代谢应激期间支持线粒体功能作用的研究一致。通过增强酮体用于能量生产，恩格列净可能提供一种替代能源，规避缺血条件下葡萄糖代谢的损害。此外，线粒体功能的恢复也可能有助于神经炎症的消退。线粒体功能障碍可导致促炎介质的释放，加剧神经炎症反应。通过维持线粒体完整性，恩格列净可能有助于减轻炎症负荷，并为恢复创造更有利的环境。恩格列净在代谢恢复中的作用超出了其对线粒体功能的直接影响。作为一种SGLT2抑制剂，恩格列净已被证明具有多效性作用，包括调节细胞代谢和增强线粒体生物合成。这些作用可能通过促进细胞适应缺血条件和支持向更高效能量代谢的转变，从而有助于整体代谢恢复。与恩格列净类似，SGLT2抑制剂达格列净和卡格列净在临床前缺血/再灌注模型中也显示出器官保护作用。尽管这三种药物都具有抗炎和线粒体保护特性，但只有恩格列净被证明可以增加循环和大脑中的BHB水平，这表明其与酮体代谢存在独特的相互作用。未来的研究应评估SGLT2抑制剂之间的生酮效力是否与神经保护功效相关。
尽管本研究为大鼠CA诱导的全脑缺血模型中恩格列净的神经保护作用提供了令人信服的证据，但它并非没有局限性。首先，啮齿动物模型无法完全复刻人类心脏骤停的异质性无血流和低血流状态、合并症、温度管理或复苏后护理。因此，尽管我们的发现提供了机制上的见解，但仍需要前瞻性临床试验来确定恩格列净是否对患者具有类似的神经保护作用。其次，该研究侧重于短期结果，并未提供恩格列净对CA后神经功能长期恢复影响的见解。第三，该研究未探讨恩格列净治疗的潜在副作用，这是临床应用的一个重要考虑因素。鉴于本研究的有希望的结果，未来的研究应旨在弥合临床前发现与临床实践之间的差距。第四，尽管ATP水平和复合物I活性的保持表明了线粒体能量代谢的改善，但不足以全面表征线粒体功能恢复。未来研究需要测量额外的电子传递链复合物（I–V）和其他参数。最后，尽管我们观察到小胶质细胞活化和促炎细胞因子的显著减少，但我们没有直接测量NF-κB/NLRP3/Caspase-1或细胞焦亡特异性标志物，如GSDMD或LDH释放。未来的研究应更详细地探讨恩格列净神经保护作用的分子机制。
结论
总之，本研究强调了大鼠CA诱导的全脑缺血模型中恩格列净的多方面神经保护作用。恩格列净通过增强酮体氧化来保护CA后的脑功能，其潜在机制与减轻神经炎症和改善线粒体能量代谢有关。这些结果凸显了恩格列净在提高CA后存活率和改善神经功能结局方面的潜在治疗益处，值得进一步的临床研究，以探索其长期效果并优化其在神经保护策略中的应用。
