《Journal of the American Heart Association》：Interferon‐γ–Responsive Microglia‐Derived Extracellular Vesicles Inhibited Neurogenesis After Stroke via MicroRNA‐199a‐5p/SIRT1 Axis
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本文揭示了脑卒中慢性期出现的一类γ-干扰素响应性小胶质细胞，其分泌的细胞外囊泡（EVs）可被神经干细胞（NSCs）内吞，通过高表达miR?199a?5p靶向抑制SIRT1，从而阻碍NSCs存活与神经元分化，最终抑制神经发生与神经功能恢复，为缺血性脑卒中治疗提供了新靶点。
研究背景与问题提出
脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。卒中后，位于脑室下区（SVZ）和海马齿状回颗粒下区的神经干细胞（NSCs）被激活、增殖并迁移至梗死周边区，通过神经发生过程促进神经功能恢复。然而，病灶区域的炎症微环境显著抑制神经发生，阻碍神经恢复。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在卒中后病理条件下对神经发生具有关键调节作用。近年单细胞RNA测序（scRNA?seq）研究揭示了卒中后小胶质细胞存在多个亚群，其中包括干扰素响应性小胶质细胞。细胞外囊泡（EVs）是介导细胞间通讯的纳米级脂膜囊泡，在缺血损伤后神经血管单元重塑中扮演重要角色。本研究旨在探究γ-干扰素响应性小胶质细胞来源的EVs对卒中后神经发生的影响及其分子机制。
研究方法概要
研究使用成年雄性小鼠建立90分钟短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型。在卒中后14天，通过scRNA?seq分析脑组织，并结合免疫染色、实时定量聚合酶链反应（RT?PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）验证卒中小鼠脑中γ-干扰素响应性小胶质细胞的存在。通过超速离心法从γ-干扰素处理的BV2小胶质细胞中分离EVs（称为γ-干扰素EVs）。在体外，用γ-干扰素EVs处理NSCs；在体内，于tMCAO后第7天开始，每隔一天通过尾静脉向小鼠注射γ-干扰素EVs。通过神经行为学测试、焦油紫染色、高尔基染色和免疫染色评估NSCs分化、神经发生及神经行为恢复情况。利用miRNA测序和生物信息学分析探索γ-干扰素EVs抑制神经发生的靶基因和信号通路。
研究结果与发现
1. 卒中后小鼠脑中γ-干扰素响应性小胶质细胞的增加
scRNA?seq数据将小胶质细胞进一步分为稳态小胶质细胞、疾病相关小胶质细胞和干扰素响应性小胶质细胞三个亚群，其中干扰素响应性小胶质细胞高表达干扰素刺激基因（ISGs），如IFIT3I、ISG15I、CXCL10C等。免疫染色和RT?PCR验证了这些细胞在卒中后14天病灶脑区的存在。ELISA数据显示卒中后γ-干扰素水平显著升高，而干扰素?α和干扰素?β无显著变化，表明这些干扰素响应性小胶质细胞主要为γ-干扰素响应性表型。
2. γ-干扰素EVs的鉴定及其对NSCs的影响
用100 ng/mL γ-干扰素刺激BV2小胶质细胞12小时，可成功诱导其呈现γ-干扰素响应性表型，细胞形态变为阿米巴样，且ISGs表达上调。从其上清中分离出的EVs具有典型的杯状形态，直径约50?200 nm，表达EV标志物CD81，而不表达内质网标志物钙联接蛋白。
在体外，CFSE标记实验显示NSCs可内吞γ-干扰素EVs。细胞计数试剂盒?8（CCK?8）检测表明，γ-干扰素EVs处理（特别是在氧?葡萄糖剥夺（OGD）条件下）会降低NSCs的存活率。免疫染色结果显示，γ-干扰素EVs处理减少了NSCs向βIII?微管蛋白（Tuj?1）阳性神经元的分化，同时增加了其向胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞的分化，表明其抑制了NSCs的神经元分化。
3. γ-干扰素EVs在体内抑制神经功能恢复与神经发生
在tMCAO后第7、9、11天向小鼠尾静脉注射γ-干扰素EVs。神经行为学测试（包括改良神经严重程度评分、高架躯体摆动测试、转棒测试、悬线测试等）显示，γ-干扰素EVs处理组小鼠的神经功能恢复受到抑制。焦油紫染色表明，γ-干扰素EVs处理增大了卒中后14天和28天的脑萎缩体积。
免疫染色显示，γ-干扰素EVs处理显著降低了脑室下区双皮质素（DCX）阳性神经母细胞的数量，同时减少了巢蛋白（Nestin）与Ki67共阳性增殖性NSCs的比例。高尔基染色进一步揭示，γ-干扰素EVs处理降低了树突棘密度。这些结果综合表明，γ-干扰素EVs在体内显著损害了卒中后的神经发生过程。
4. miR?199a?5p是γ-干扰素EVs抑制神经发生的关键效应分子
miRNA芯片比较γ-干扰素EVs与未刺激小胶质细胞来源的EVs（naive EVs），发现γ-干扰素EVs中12种miRNAs表达上调，包括miR?206?3p、miR?100?5p和miR?199a?5p等。RT?PCR验证了这三种miRNAs的上调。在NSCs中转染这三种miRNA的模拟物，发现只有miR?199a?5p模拟物能显著抑制NSCs存活并减少其向神经元分化，而不影响细胞增殖，这模拟了γ-干扰素EVs的效果。
为进一步验证，研究从miR?199a?5p敲低（miR?kd）的γ-干扰素响应性小胶质细胞中分离EVs。与注射对照EVs的卒中小鼠相比，注射miR?kd EVs的小鼠神经行为恢复更好，脑萎缩体积减小，树突棘密度增加，脑室下区DCX阳性细胞和增殖性NSCs数量增多。这些数据表明，敲低γ-干扰素EVs中的miR?199a?5p可以部分逆转其对神经发生的抑制作用。
5. miR?199a?5p通过靶向SIRT1S抑制NSCs功能
通过miRDB、TarBase和TargetScan数据库预测miR?199a?5p的潜在靶基因，并利用RT?PCR在转染miR?199a?5p模拟物的NSCs中进行验证，发现只有SIRT1S的mRNA表达被显著下调。双荧光素酶报告基因实验证实，miR?199a?5p可直接结合SIRT1SmRNA的3'非翻译区并抑制其表达。
使用SIRT1S激动剂SRT1720处理NSCs，可上调SIRT1S表达。重要的是，SRT1720预处理能够逆转miR?199a?5p模拟物对NSCs存活和神经元分化的抑制作用。这证实了SIRT1S是miR?199a?5p下游的功能性效应靶点。
讨论与结论
本研究在卒中慢性期鉴定出一群γ-干扰素响应性小胶质细胞。这些细胞分泌的EVs可被NSCs内吞，通过富含的miR?199a?5p靶向抑制SIRT1S的表达，从而降低NSCs的存活率、抑制其向神经元分化，最终损害神经发生和神经功能恢复。该发现不仅深化了对卒中后神经修复机制的理解，也为开发通过靶向调节miR?199a?5p/SIRT1S轴来促进神经发生和功能恢复的治疗策略提供了新的科学依据和潜在靶点。
研究也存在一些局限性，例如使用了BV2小胶质细胞系而非原代细胞，实验仅纳入雄性小鼠以避免雌性激素周期的干扰，且未评估EVs对神经元电生理功能的直接影响。未来研究需纳入雌性小鼠并采用电生理学技术，以更全面地评估EVs对神经功能的影响。
