《Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation》：Low Prevalence and Inconsistency of LRP4-IgG Detection in Suspected Myasthenia Gravis: A Multicenter CBA Comparison
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这篇研究聚焦于重症肌无力（MG）中的新型自身抗体LRP4-IgG，通过多中心、多种细胞实验（CBA）方法的直接比较，揭示了其临床检出率低（总体约2%）、不同检测方法（如甲醇固定CBA vs. 甲醛固定CBA）结果差异显著且跨中心可重复性有限。研究结果提示，当前LRP4-IgG检测的诊断价值有限，且存在假阳性风险，尚不足以作为MG的常规筛查指标，为临床实践和未来检测方法标准化提供了关键证据。
摘要
重症肌无力是一种由针对神经肌肉接头蛋白的自身抗体引起的罕见自身免疫性疾病。其中，乙酰胆碱受体和肌肉特异性酪氨酸激酶抗体是主要致病因子，但仍有10-20%的患者为双血清阴性。低密度脂蛋白受体相关蛋白4被认为是潜在的新抗原靶点，但其抗体检测频率和临床意义因检测方法和研究人群差异而存疑。本研究通过多中心观察，采用三种不同的细胞实验（活细胞、甲醇固定、甲醛固定）检测了疑似MG患者中的LRP4-IgG，发现其检出率低，且不同方法间一致性差，表明当前常规检测意义有限。
引言
重症肌无力是一种以肌肉无力和易疲劳为特征的罕见自身免疫病。约80-85%的患者可检测到乙酰胆碱受体抗体，5-10%可检测到MuSK抗体，但仍有约10-20%的患者呈双血清阴性，给临床管理带来挑战。LRP4作为LDLR家族成员，成为潜在的抗原靶点。已有研究使用不同的细胞实验或酶联免疫吸附法检测LRP4抗体，报告频率从0%到50%以上不等，差异巨大，突显了其流行率和临床意义的不确定性。本研究旨在通过比较三种文献中最常见的CBA方案，评估LRP4抗体在意大利多中心疑似MG患者中的频率。
方法
研究从五个意大利中心招募了连续出现疑似MG症状的患者。样本在两个中心进行测试。所有患者均使用CBA方法检测AChR和MuSK抗体，最终诊断基于临床表现、电生理学发现及对治疗的反应，分为MG或其他疾病。双血清阴性MG定义为AChR和MuSK抗体阴性，并满足至少一项附加诊断标准。
为检测LRP4抗体，两个测试中心建立了三种不同的CBA方案：活细胞CBA（1-CBA）、甲醛固定CBA（pf-CBA）和甲醇固定CBA（mf-CBA）。简要而言，HEK293T细胞被转染LRP4质粒，在不同方案下进行固定（或不固定）、封闭，并与患者血清样本孵育。使用商业小鼠LRP4单克隆抗体作为阳性对照。荧光显微镜分析由两名操作者独立进行，采用半定量评分法。结果模棱两可或阳性的样本至少复测两次，并进行共定位实验以确认抗体特异性。阳性样本在两个中心间交换以评估跨中心一致性。
结果
队列特征
研究共纳入684名患者：302例MG，382例其他疾病。两个队列的人口统计学特征相似，但队列1中MG病例比例更高，且眼肌型和全身型MG的分布存在差异。
LRP4抗体检测与临床特征
使用甲醇固定CBA，在684名患者中检测到8例LRP4-IgG阳性（1.16%），共定位实验证实了这些发现。然而，其中仅50%的结果被甲醛固定CBA确认。值得注意的是，甲醇固定CBA或甲醛固定CBA检测出的阳性样本，均未在活细胞CBA中显示阳性。总体而言，LRP4-IgG在302例MG患者中检出6例（2%），在382例其他疾病患者中检出2例（0.52%）。在MG患者中，LRP4-IgG在200例血清阳性病例中检出2例（1%），在102例双血清阴性MG病例中检出4例（3.9%）。按临床表型分层，187例全身型MG患者中检出1例（0.53%），而115例眼肌型MG患者中检出5例（4.3%），差异具有统计学意义。
跨中心验证
两个中心交换并交叉测试了他们的阳性样本，结果显示结果仅部分一致，突显了LRP4-IgG检测的可变性。
讨论
过去几十年中，LRP4已成为双血清阴性MG患者中一种新型自身抗原。在这项大型多中心研究中，使用甲醇固定CBA在疑似MG患者中检出的LRP4-IgG总体频率较低，且与甲醛固定CBA的一致性仅为50%，活细胞CBA则无阳性发现。LRP4-IgG在部分其他神经系统疾病患者中也呈阳性，引发了对其特异性的质疑。
影响LRP4-IgG检测的一个关键因素可能是固定剂的类型。甲醇是一种凝固性固定剂，会通过蛋白质变性和细胞脱水诱导蛋白质沉淀，可能人为暴露细胞内或变性的表位，从而增加假阳性率。相比之下，甲醛能更好地保存天然蛋白质构象。本研究低的一致性支持这一担忧。
另一个问题是不同实验室间检测的可重复性。两个中心间的交叉测试显示结果仅部分一致，强调了在LRP4抗体检测可用于常规临床实践之前，对其进行标准化和实验室间验证的迫切需求。
本研究的局限性包括两个患者队列在MG患病率上存在显著差异，以及眼肌型与全身型病例比例不同，这可能引入选择偏倚。尽管如此，我们的研究结果与先前研究一致，即LRP4抗体罕见且诊断相关性不确定。虽然实验模型显示了这些抗体的潜在致病作用，但临床上LRP4-IgG阳性患者通常症状轻微，缺乏区别于AChR-IgG MG患者的独特临床表型，并且对常规治疗反应良好。这表明其中一些患者可能同时携带有只能通过CBA检测到的低亲和力AChR抗体。
总之，本研究认为LRP4抗体在MG患者（包括双血清阴性MG）中检出率低，且在其他神经系统疾病患者中也可能被检测到。不同检测方法间的差异性以及跨中心可重复性差，限制了LRP4-IgG检测当前的诊断效用。目前，不推荐在MG中常规筛查LRP4抗体，且仅凭LRP4阳性不应被视为足以在没有相容的临床和电生理学发现的情况下确立MG诊断。开发特异、敏感、可重复且在中心间经过验证的检测方法，对于确定LRP4抗体在MG中的真正诊断意义至关重要。
