《Journal of the American Heart Association》：Aging‐Associated Nox4‐Mediated Mitochondrial Reactive Oxygen Species and DNA Damage Promote Vascular Cell Reprogramming and Aortic Remodeling in Abdominal Aneurysms
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这篇综述系统阐述了衰老相关的NOX4（NADPH oxidase 4）通过驱动线粒体活性氧（mtROS）和线粒体DNA（mtDNA）损伤，激活cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes）等DNA感应通路，从而诱导血管平滑肌细胞（SMC）向巨噬细胞样表型转变，最终导致腹主动脉瘤（AAA）发生发展的分子机制，为靶向线粒体氧化应激和DNA损伤通路治疗AAA提供了新的理论依据和潜在靶点。
衰老与NADPH氧化酶4（NOX4）在腹主动脉瘤中的作用
腹主动脉瘤（AAA）是西方世界的主要死亡原因之一，其发生与衰老和男性性别等风险因素密切相关。本研究的背景在于，虽然氧化应激（OS）在实验性AAA中被证明具有致病作用，但线粒体氧化应激（mtOS）的具体机制尚不明确。既往研究提示，NADPH氧化酶家族成员NOX4的表达和活性随年龄增长而增加，并促进线粒体氧化应激和血管功能障碍。然而，NOX4驱动的mtOS和mtDNA损伤在AAA发病过程中，通过血管细胞重编程和血管壁重塑所起的作用尚未被探索。本研究旨在填补这一空白。
研究方法
本研究采用多种实验体系进行探究。首先，使用了线粒体靶向过表达Nox4的转基因小鼠（Nox4TG）与载脂蛋白E敲除（Apoe-/-）小鼠杂交，构建血管紧张素II（Ang II）诱导的AAA模型。实验组包括Apoe-/-、Apoe-/-/Nox4TG和Apoe-/-/Nox4-/-小鼠。通过超声评估AAA发生率和主动脉形态，并检测活性氧水平、DNA损伤标志物和血管壁重塑参数。血管细胞群通过光谱流式细胞术和基因表达谱进行分析。在体外，对从野生型、Nox4TG和Nox4-/-小鼠分离的血管平滑肌细胞（VSMCs）进行Ang II处理，评估其线粒体活性氧、DNA损伤以及炎症通路激活情况。此外，研究还使用了人类AAA和对照主动脉组织样本，通过蛋白质印迹、免疫荧光等方法分析NOX4表达、线粒体活性氧和DNA损伤标志物。
实验结果
人类腹主动脉瘤中NOX4依赖性线粒体氧化应激增加
对主动脉组织样本的分析显示，与对照主动脉相比，人类AAA样本中的NOX4蛋白水平显著增加。免疫荧光分析进一步证实，AAA组织中NOX4的免疫反应性及其与线粒体标志物ATP5G的共定位显著增强。同时，通过MitoSOX荧光检测发现，AAA组织中的线粒体活性氧水平也显著升高。DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）与线粒体蛋白ATP5G的共定位在AAA组织中显著增加，表明氧化性DNA损伤主要定位于线粒体。
NOX4表达增加促进Apoe-/-小鼠AAA发展
在Ang II诱导的AAA小鼠模型中，Apoe-/-/Nox4TG小鼠表现出最高的AAA发生率、主动脉扩张程度、活性氧水平、DNA损伤和炎症反应。而Nox4-/-/Apoe-/-小鼠则受到最大程度的保护。组织学分析（Verhoeff-Van Gieson染色）显示，Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉的弹性蛋白降解和板层结构破坏更为严重。
线粒体氧化应激增加驱动Apoe-/-小鼠AAA中主动脉壁细胞的表型调节
在Ang II输注28天后的小鼠主动脉切片中，Nox4TG/Apoe-/-小鼠的细胞内和线粒体活性氧水平均显著高于Nox4-/-/Apoe-/-小鼠。与线粒体蛋白TOMM20共定位的8-OHdG水平也在Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠中显著升高。免疫荧光分析表明，在Ang II处理的Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉中，平滑肌细胞收缩标志物ACTA2（平滑肌肌动蛋白α2）的表达减少，而炎症性白细胞标志物CD11b的表达增加，提示NOX4驱动的活性氧产生和氧化损伤与收缩性平滑肌细胞表型的丧失及炎症特征的发展相关。
NOX4依赖性线粒体功能障碍介导Ang II诱导的主动脉平滑肌细胞促炎表型转换
对原代血管平滑肌细胞的研究发现，Ang II刺激后，Nox4TG VSMCs中的线粒体活性氧和8-OHdG水平（指示氧化性DNA损伤）增加最为显著。线粒体功能评估显示，Ang II处理降低了所有细胞的氧消耗率（OCR），其中Nox4-/-VSMCs的OCR最高，而Nox4TG细胞的OCR最低。流式细胞术分析显示，Ang II暴露显著降低了野生型和Nox4TG VSMCs中表达收缩标志物MYH11（肌球蛋白重链11）和TAGLN（转胶蛋白）的细胞比例，但增加了表达巨噬细胞标志物CD68和CD11b的细胞比例，表明NOX4依赖性线粒体功能障碍驱动了VSMCs向促炎表型转变。
AAA中DNASE2表达与NOX4表达及线粒体DNA损伤相关
与观察到的线粒体DNA损伤增加一致，脱氧核糖核酸酶II（DNASE2）的蛋白表达在Ang II处理的Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉的ACTA2+区域以及CD68+巨噬细胞富集区域显著升高。同样，在人AAA样本的蛋白质印迹分析中也观察到DNase2蛋白水平显著上调，提示NOX4介导的线粒体DNA损伤和胞质渗漏可能驱动了DNASE2的上调。
线粒体DNA损伤激活Ang II处理的Nox4TG血管平滑肌细胞和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉中的胞质DNA感应
蛋白质印迹分析显示，在Ang II处理的Nox4TG VSMCs中，cGAS（环GMP-AMP合成酶）蛋白水平显著增加。cGAS的激活产物2‘3’-cGAMP在Nox4TG细胞中的胞质水平也显著升高。STING（干扰素基因刺激因子）及其磷酸化形式（p-STING）在Ang II处理的Nox4TG细胞和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉组织中的表达水平最高。在人AAA样本中，cGAS和STING的免疫反应性蛋白水平也显著高于对照主动脉组织，表明该通路参与了动脉瘤的病理生理过程。
炎症驱动的血管细胞表型改变是AAA的特征
免疫荧光显微镜显示，与对照相比，人AAA组织中炎症性巨噬细胞标志物CD68显著增加，而平滑肌细胞收缩标志物ACTA2显著减少。促炎细胞因子IL-1β和IL-6的水平在AAA样本中也显著升高，支持血管平滑肌细胞向促炎状态转变有助于AAA发病的假设。
线粒体NOX4表达增加与AAA发展过程中主动脉平滑肌细胞的促炎巨噬细胞样表型相关
通过光谱流式细胞术分析Ang II处理28天后小鼠主动脉组织的细胞群，发现与Nox4-/-/Apoe-/-小鼠相比，Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉中MYH11+细胞比例减少，而CD45+CD68+CD11b+炎症细胞比例以及共表达MYH11和巨噬细胞标志物（CD68、CD11b）的细胞比例显著增加。无偏倚的t-SNE聚类分析进一步将MYH11+细胞分为三个不同的亚群：高表达CD11b和TNFα的巨噬细胞样平滑肌细胞（簇1）、高表达CD45、CD68、IL-1β和IL-6的巨噬细胞样平滑肌细胞（簇2），以及高表达CNN1和ACTA2的收缩型平滑肌细胞（簇3）。簇1和簇2在Apoe-/-和Nox4TG/Apoe-/-小鼠主动脉中富集，而簇3则在Nox4-/-/Apoe-/-小鼠主动脉中显著富集。这些发现表明，NOX4在促进平滑肌细胞向促炎、巨噬细胞样状态转变中起着关键作用。
讨论与结论
本研究揭示了线粒体NOX4衍生的活性氧在AAA发病过程中驱动平滑肌细胞表型转换、炎症和主动脉壁重塑的关键作用。研究结果阐明了一个机制级联：线粒体NOX4促进氧化应激和线粒体DNA损伤，最终激活对氧化还原敏感的内在免疫信号通路（如cGAS-STING通路），从而调控平滑肌细胞的命运决定和血管稳态。这种表型可塑性表现为收缩标志物（如ACTA2、MYH11、TAGLN）的下调和巨噬细胞标志物（如CD68、CD11b）的上调。基因证据表明，NOX4是AAA易感性的候选基因，本研究通过小鼠模型和人类组织分析为这一关联提供了功能验证。靶向线粒体氧化应激或下游DNA感应通路，例如使用线粒体靶向抗氧化剂或NOX4抑制剂，可能为延缓或预防AAA进展，尤其是对于小型无症状动脉瘤患者，提供一种新的治疗策略，从而可能减少手术修复的需求。未来的研究应探索这些通路在人类AAA队列，特别是小型无症状动脉瘤患者中的临床相关性。
