微波辅助水解用于功能性甲基丙烯酸酯聚合物及其生物偶联物的物理化学表征

《Analytical Methods》：Microwave-assisted hydrolysis for the physicochemical characterization of functional methacrylic polymers and their bioconjugates

作为编辑，向您推荐这篇研究：该工作建立了一种基于微波辅助水解（MAH）与水性尺寸排阻色谱（ASEC）联用的新方法，用于精确测定通过“接枝自”策略合成的功能化甲基丙烯酸酯聚合物及其蛋白质偶联物的摩尔质量。通过水解侧链酯键将聚合物转化为线性聚甲基丙烯酸（PMAA），解决了传统尺寸排阻色谱（SEC）对表面接枝或生物偶联聚合物表征不准确的难题。该方法在聚甘油甲基丙烯酸酯（PGMA）、聚乙二醇甲基丙烯酸酯（P(PEGMA)）及溶菌酶?PGMA偶联物上得到验证，证明微波加热能显著提升水解效率与转化率，为生物医学与材料科学中复杂聚合物系统的表征提供了可靠、高效的分析平台。

　　

1. 引言

微波辅助水解（MAH）是一种通过微波辐射加速反应速率以提高传统水解效率的新兴技术。该方法可实现快速均匀加热，与传统方法相比显著缩短反应时间并降低能耗。MAH 在分解复杂生物分子（如木质纤维素生物质、蛋白质、淀粉和甲壳素等多糖）以及合成聚合物方面特别有效。随着绿色化学和可持续技术兴趣的增长，MAH 已在生物燃料生产、塑料回收和药物分析等领域得到广泛应用。该方法的突出优势包括反应时间大幅缩短（从数小时缩短至数分钟）、高能效、低试剂用量以及潜在的产率和选择性提升。MAH 主要可以三种形式进行：使用盐酸或硫酸等强酸的酸水解；涉及氢氧化钠或氢氧化钾等碱的碱水解；以及可与微波处理结合的酶水解，不过酶对高温可能敏感。

基于这些特点，MAH 也可用于优化或控制先进聚合物材料的水解，实现对高分子链的快速、准确和可靠的物理化学表征。这对于通过“接枝自”方法接枝到纳米颗粒或生物表面、交联或与蛋白质和核酸等大生物分子偶联的大分子尤其相关。在此类情况下，通常需要先将其从接枝或偶联伙伴上解离，才能进行有效的分析和表征。在聚合物-蛋白质偶联物领域，最近提出了一种方法，可在强酸或强碱条件下完全水解单体单元的侧基和蛋白质组分，从而分离出聚合物主链用于摩尔质量表征。

目前，对于接枝聚合物以及在溶液中具有复杂自组装行为的工程聚合物的表征，现有分析策略通常依赖于无法提供关于真实物理化学性质（尤其是摩尔质量分布）的准确或可靠信息的技术。最常用的摩尔质量测定方法包括尺寸排阻色谱（SEC）、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、分析超速离心（AUC）和场流分级分离（FFF）。由于 SEC 应用范围广、易于使用且普及度高，它仍然是最广泛使用的技术。然而，测定接枝到表面的聚合物的分子量分布具有挑战性，因为其共价锚定的链无法直接用 SEC 分析，除非首先将其从表面解离。此外，当这些聚合物的行为不理想线性卷曲时，SEC 可能会产生不准确的结果；蛋白质偶联物、自组装、折叠或强分子间相互作用的存在可能会扭曲流体力学体积测量。

为解决这些局限性，一种有效的方法是裂解聚合物接枝基团及其侧链官能团，从而分离出线性聚合物主链，进而通过 SEC 进行分析。当聚合物主链在水解过程中稳定时（例如聚烯烃、聚甲基丙烯酸酯和聚丙烯酸酯），这种方法成为可能。特别是，聚甲基丙烯酸酯和聚丙烯酸酯最近已在各种不同的生物医学应用中用作偶联、接枝、自组装大分子，这也是本工作的主要焦点。同时，（甲基）丙烯酸酯聚合物在文献中涵盖了广泛的拓扑结构、功能性和加工策略，包括具有可调表面性质的刺激响应材料以及为先进粘合剂和光电应用开发的多功能聚合物。实际上，通过可控活性聚合技术（如原子转移自由基聚合（ATRP）、可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合或氮氧稳定自由基聚合（NMP））实现的通用合成已被广泛探索，以获得具有窄分子量分布和明确结构的聚合物。

特别是，这些可逆失活自由基聚合（RDRP）技术使得接枝甲基丙烯酸酯聚合物（如聚乙二醇甲基丙烯酸酯（P(PEGMA)）和聚甘油单甲基丙烯酸酯（PGMA)）在生物医学应用中得到深入研究。它们的无毒性质、亲水性和抗蛋白质吸附特性使其成为药物递送、组织工程和生物材料表面改性的理想选择，可在医疗环境中增强生物功能性、稳定性和免疫相容性。与许多其他（甲基）丙烯酸酯单体以及在这些可控活性聚合中使用的引发剂一样，PGMA 和 PPEGMA 的官能团存在酯键，可通过水解裂解。

鉴于上述考虑，本工作重点开发一种有效的表征方法，用于测定通过可控活性聚合合成的功能化聚合物的摩尔质量。该方法涉及使用 MAH 水解其侧链中的酯键，从而在每个单体单元上产生带有羧酸基团的线性甲基丙烯酸酯主链，即聚甲基丙烯酸（PMAA），适用于后续分析。一旦通过水性 SEC 表征了 PMAA 的摩尔质量分布，就可以轻松计算出聚合度，从而得出水解前聚合物的摩尔质量。该研究旨在优化使用微波合成器进行的碱催化水解的反应条件。为评估水解动力学，将 PGMA 与空间位阻更大的 P(PEGMA) 进行了比较。研究了两种水解设置：一种使用传统的传导加热（例如硅油浴），另一种采用微波辅助水解，预计后者可加速反应并提高转化率。

本研究中所研究的 PGMA 和 PPEGMA 均聚物是通过在水溶液中使用电子转移活化剂再生（AGET）ATRP 技术从商业引发剂合成的。鉴于 PGMA 形成稳定的聚合物-蛋白质生物偶联物的潜力，基于我们之前的工作，也在功能化的溶菌酶（作为模型蛋白质大引发剂）上进行了 PGMA 聚合。该生物偶联物是通过将带有醛基的 ATRP 引发剂通过还原胺化共价连接到溶菌酶的 N 末端制备的，目标位点远离活性结构域以保留酶活性。随后，将所得 PGMA-溶菌酶偶联物在先前为相应均聚物建立的优化条件下进行水解，从而能够对基于甲基丙烯酸酯的聚合物进行表征。为了提高分子量测定的准确性，使用了一系列不同链长的 PGMA 样品来校准水性 SEC 分析，减少了通常与使用商业聚合物校准剂进行标准校准相关的系统误差。

此处，MAH 是作为分析工作流程的一个组成部分引入的，而不是作为合成工具。首先从已知摩尔质量的聚合物生成聚合物衍生的内部校准剂，随后将其应用于结构相关的功能聚合物和未知摩尔质量的生物偶联物的表征，克服了由于聚合物化学、电荷密度和流体力学体积差异而导致的传统 SEC 校准的内在局限性。

2. 实验

2.1. 材料

列出了研究中使用的所有化学品、试剂、蛋白质和溶剂，包括来源和纯度，所有化学品除非另有说明，均未经进一步纯化使用。去离子水由 Millipore Milli-Q 纯化系统提供。

2.2. 聚合物表征

通过 ¹H-NMR 分析确定单体转化率（χ_ATRP）和水解结果（χ_HYDRO）以及聚合物的聚合度（DP）。¹H-NMR 光谱在 298 K 下使用 Bruker Avance 400 MHz 仪器记录。合成的聚合物的数均摩尔质量（M_n,SEC）和多分散性指数（?_SEC= M_w,SEC/M_n,SEC）值使用配备有折射率检测器、柱温箱、泵、自动进样器、GRAM 色谱柱和预柱的 Jasco? LC-2000Plus 尺寸排阻色谱仪评估，以 DMAc（含 30 mM LiBr）为洗脱液。该仪器通过聚苯乙烯标准品进行校准。将纯化后的聚合物样品溶解在 DMAc 中，过滤后进样分析。

水解后的聚合物通过水性 SEC（ASEC）进行分析，该系统由 Shimadzu Nexera LC 系统、泵、脱气装置、自动进样器、柱温箱、Agilent PL aquagel-OH 预柱和 Agilent PL aquagel Mixed-M 分析柱以及折射率检测器组成。流动相由 0.2 M NaNO₃、0.1 M NaH₂PO₄（pH 7）和 200 ppm NaN₃组成。流速设置为 1 mL min^-1。数均和重均摩尔质量（M_n,ASEC和 M_w,ASEC）以及多分散性指数（?_ASEC）根据聚乙二醇（PEG）标准品的校准计算。

此外，还通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析了原始和水解后的聚合物样品，使用配备 ATR 附件的 Varian 640-IR 光谱仪。

2.3. 从商业引发剂合成 PGMA_m

描述了在 PBS 缓冲液中通过 AGET ATRP 合成具有不同目标聚合度（m = 20, 50, 80, 125）的 PGMA_m均聚物的详细步骤，包括反应物的用量、脱气程序、反应条件（30°C，18小时）、纯化过程（透析、冻干）以及 ¹H-NMR 特征峰归属。

2.4. 从商业引发剂合成 P(PEGMA)_n

描述了在 PBS 缓冲液中通过 AGET ATRP 合成目标聚合度为 250 的 P(PEGMA)_n均聚物的详细步骤，包括反应物的用量、脱气程序、反应条件（30°C，18小时）、纯化过程（透析、冻干）以及 ¹H-NMR 特征峰归属。

2.5. PGMA_m的水解

描述了 PGMA_m在 3 M NaOH 溶液中，于 120°C 油浴加热系统中进行常规碱催化水解的步骤，研究了不同反应时间（30分钟至18小时）下的水解进程。反应产物用 HCl 中和，透析后冻干。

2.6. P(PEGMA)_n的水解

描述了 P(PEGMA)_n在 3 M 或 6 M NaOH 溶液中，于 120°C 油浴加热系统中进行常规碱催化水解的步骤，研究了不同反应时间（30分钟至18小时）下的水解进程。反应产物用 HCl 中和，透析后冻干。

2.7. PGMA_m的微波辅助水解

描述了 PGMA_m或 LYS-PGMA_m在 3 M NaOH 溶液中，于 Biotage? Initiator + 微波合成器中进行微波辅助水解的步骤，研究了不同反应时间（5分钟至3小时）下的水解进程。反应在 120°C（400 W）下进行，反应结束后快速冷却，产物经中和、透析、冻干处理。

2.8. P(PEGMA)_n的微波辅助水解

描述了 P(PEGMA)_n或 LYS-P(PEGMA)_n在 6 M NaOH 溶液中，于 Biotage? Initiator + 微波合成器中进行微波辅助水解的步骤，研究了不同反应时间（30分钟至14小时）下的水解进程。反应在 120°C（400 W）下进行，反应结束后快速冷却，产物经中和、透析、冻干处理。

3. 结果与讨论

3.1. 聚合物设计与表征

PGMA_m和 P(PEGMA)_n聚合物通过在水溶液（100 mM PBS）中进行的 AGET ATRP 合成，使用 CuBr₂或 CuCl_{2> 作为催化剂，TPMA 作为配体，抗坏血酸作为催化剂活化剂。反应首先使用商业引发剂（OH-EBiB）进行，后来使用功能化的鸡蛋清溶菌酶（LYS-A1）作为模型蛋白质。该蛋白质通过还原胺化进行化学修饰，在其 N 末端引入一个含溴基团，可作为 ATRP 引发剂用于合成目标聚合物。详细的修饰和表征步骤在先前发表的文章中提供。}

对于 PGMA_m的合成，最初选择的理论聚合度（DP_th）为 125 个单元，而 P(PEGMA)_n的聚合 DP_th为 250 个单元。所得聚合物用于研究使用微波和常规加热方法的水解动力学。随后合成了具有不同链长的 PGMA_m样品（DP_th= 80, 50, 20），以突出它们不同的分子量如何反映在相应水解聚合物的 SEC 分析中。随后调整聚合过程，使用 LYS-A1 作为引发剂，目标 DP_th为 125 和 250 个单元以合成 LYS-PGMA_m。合成程序和反应组分与使用商业引发剂优化的方案保持一致。

3.2. PGMA_m均聚物的水解

具有甲基丙烯酸主链的聚合物通常在升高的温度下通过水溶液中的碱催化反应进行酯键水解。选择碱性条件是为了确保水解过程中形成的 PMAA 的溶解性。本研究使用微波合成器和常规加热方法（例如带有热电偶控温的油浴加热系统），在 120°C 的 3 M NaOH 溶液中研究了 PGMA₁₁₂（DP_th= 125，DP_NMR= 112）水解的动力学曲线。

为了确定完全水解所需的最短时间，对两种方法测试了不同的反应时长。每次反应后，将所得混合物用 HCl 中和，并对去离子水透析以去除中和过程中形成的盐以及任何残留的甘油，然后通过 ¹H-NMR 测定转化率。如图 2a 所示，PGMA_m的典型水解机制导致线性聚甲基丙烯酸（PMAA_m）和甘油的生成。相应地，各种反应的结果通过计算水解反应前记录的 ¹H-NMR 谱图中与主链结合的甘油对应的峰面积（图 2b 中标记为‘B’、‘C’和‘D’）与水解后同一峰面积的比值来量化。这种方法能够确定因水解过程而从主链上脱离的甘油百分比。

通过比较水解后（纯化前）获得的样品的 ¹H-NMR 谱图与原始 PGMA_m聚合物的谱图，仍然可以观察到与甘油相关的峰。在纯化后记录的谱图中，甘油消失，3.4-4.2 ppm 区域的信号缺失证明了这一点，仅留下对应于线性 PMAA 链的峰。图 3a 说明了使用微波辐射和常规油浴加热进行的水解反应的动力学曲线。数据清楚地表明，微波辅助过程显著更快且更高效，仅在 1 小时内即可实现处理聚合物的完全水解。相比之下，使用标准油浴仅在 6 小时后才能获得相同的结果。这一结果证实，即使使用相同的基本条件、浓度和温度，微波辐射在加速该过程方面也具有显著效果。微波加热效率的提高可归因于其提供的均匀且快速的能量分布，导致更快的分子相互作用和更有效的系统能量传递。与传统的传导加热方法（其传热较慢且不均匀）相比，这导致反应时间显著缩短。

为了支持这些观点，图 3b 和 SI 中的图 S2 分别呈现了在 PGMA₁₁₂水解前以及在使用微波辐射和油浴加热进行的水解反应期间不同时间点采集的 ¹H-NMR 谱图序列。从系列谱图中可以明显看出，当使用微波辐射时，3.4-4.4 ppm 区域（对应于结合到聚合物主链上的甘油部分——标记‘B’、‘C’、‘D’）的信号在反应过程中比传统传导加热下降得更快。

同时，图 4 比较了未水解的 PGMA₁₁₂聚合物与使用微波辅助加热系统在不同反应时间（15 分钟和 1 小时）获得的产物的 FTIR 光谱。在未水解的光谱中观察到 2800 至 3000 cm^-1区域的亚甲基和甲基伸缩振动，对应于原始 PGMA 脂肪族基团的频率。此外，还识别出与 1700 cm^-1处的 C-O-C 酯相关的特征峰。相反，水解聚合物的光谱显示脂肪族链信号（CH₂和 CH₃约 2900 cm^-1）显著减弱，并且酯相关峰（约 1700 cm^-1）逐渐消失，取而代之的是约 1550 cm^-1处羧酸盐的 C=O 羰基伸缩振动，清楚地表明水解转化率随反应时间增加，且在 1 小时时已实现完全裂解。比较未水解 PGMA₁₁₂与通过油浴加热程序获得的水解聚合物的 FTIR 光谱见 SI 中的图 S3。

图 3 和图 4 中报告的两组分析都清楚地表明了反应随时间推移的进程。值得注意的是，对应于不同时间点的每个反应均对两种加热方法进行了三次重复，确保了研究结果的可靠性和一致性。

3.3. LYS-PGMA_m偶联物的水解

鉴于先前使用微波合成器和油浴加热系统在 PGMA₁₁₂上成功获得水解结果，后续沿用先前优化的条件来实现 LYS-PGMA_m偶联物（DP_th= 125, DP_NMR= 109）的水解。首先测试了油浴加热方案以验证其有效性，随后将该反应转移到微波辅助方案中。通过 ¹H-NMR 光谱分析反应产物，证实了与先前为水解 PGMA₁₁₂所展示的相同化学位移，归因于偶联物的成功水解。

图 5 突出了未水解的 PGMA₁₁₂聚合物、未水解的 LYS-PGMA₁₀₉偶联物以及 LYS-PGMA₁₀₉在微波辅助加热系统中水解 1 小时后的 FTIR 光谱。在 PGMA₁₁₂和 LYS-PGMA₁₀₉的未水解光谱中均观察到 2800 至 3000 cm^-1区域的亚甲基和甲基伸缩振动，以及 1700 cm^-1处的 C-O-C 酯峰。相反，在水解聚合物的光谱中，脂肪族链信号（CH₂和 CH₃约 2900 cm^-1）显著减弱，且酯相关峰（约 1700 cm^-1）消失，证实了 LYS-PGMA₁₀₉在 1 小时内被成功水解。

3.4. P(PEGMA)_n均聚物的水解

与使用 PGMA₁₁₂进行的实验并行，也对 P(PEGMA)_n聚合物（DP_th= 250, DP_NMR= 245）进行了水解测试。P(PEGMA)_n的一般水解机制导致线性 PMAA_n和聚乙二醇甲醚（PEG）的形成，这是 P(PEGMA) 酯键裂解的结果，如图 6a 所示。

初步实验涉及在油浴中使用 3 M 的 NaOH 水溶液在 120°C（与 PGMA 水解相同的反应条件）下进行聚合物水解，在反应 18 小时后得到的结果不令人满意（转化率 < 10%）。P(PEGMA) 抗水解的增强稳定性可能源于 PEG 侧链的空间位阻，以及其在温度高于其较低临界溶解温度（LCST）85-90°C 以上时倾向于脱水。因此，后续研究通过将 NaOH 溶液的摩尔浓度提高到 6 M 来进行。随后的研究使用微波合成器和常规油浴（对应于先前描述的设置），在 120°C 的 6 M NaOH 溶液中检查了 P(PEGMA)₂₄₅水解的动力学曲线。

评估了两种方法的不同反应时间。每次反应后，将所得混合物用 HCl 中和，对去离子水透析以消除盐和作为副产物的游离 PEG，然后通过 ¹H-NMR 评估转化率。通过计算水解反应前记录的 ¹H-NMR 谱图中对应于连接到主链的 PEG 侧链的峰面积（图 6 中标记为‘B’和‘C’）与水解后同一峰面积的比值来量化反应结果。这种方法允许确定因水解过程而从主链脱离的 PEG 百分比。为了确认反应导致了连接 PEG 侧链与 PMAA 主链的酯键的裂解，监测了对应于 PEG 侧链末端甲基的峰（‘D’，δ = 3.5 ppm）的存在。这确保了裂解没有发生在乙二醇单元的醚键处。从图 6b 描绘的光谱可以看出，在微波辐射的情况下，随着反应时间的增加，对应于连接到主链的 PEG 侧链的亚甲基基团的峰面积（3.2–4.4 ppm 区域）逐渐减少，达到其初始值的约 13%。同时，对应于 PEG 末端甲基的峰相对于其他峰保持比例一致（在 ¹H-NMR 光谱处理导致的积分误差范围内）。因此，显然更长的反应时间可以增加有效裂解的酯基数量。在油浴中进行的反应记录的光谱进展中观察到了类似的趋势（图 S4）；然而，在这种情况下，标记为‘B’、‘C’和‘D’的峰面积的减少最多限于 20%。

图 7 展示了使用微波辐射和常规油浴加热进行的 P(PEGMA)₂₄₅水解反应的动力学曲线。在这两种情况下，均未实现 100% 的水解；然而，微波辅助过程明显表现出最佳性能，在 8 小时内实现了约 87% 的平均水解率。尽管尝试增加反应时间，但在 14 小时后，该过程达到一个平台期，在此之后未观察到性能的进一步改善。相比之下，使用标准加热即使将反应时间延长至 18 小时，也无法超过 20% 的水解率。这些结果证实，在相同温度和碱浓度下，微波辐射在促进水解过程方面比油浴方法更有效。

即使在长时间的微波辐射下，P(PEGMA) 的不完全水解也与先前的观察结果一致，并且可以通过限制该聚合物可水解性的结构和物理化学因素组合来合理化。PEG 侧链提供的空间屏蔽预计会随着水解的进行逐渐阻碍氢氧化物接近主链上的酯基团。此外，在高于 PEG 基聚合物的 LCST 的温度下，可能发生部分脱水和链塌陷，促进局部致密化或聚集，进一步限制了试剂的扩散。随着残留 PEG 侧链比例的降低，这种效应可能加剧，导致反应环境不均匀和转化率进入平台期。最后，沿着聚合物链的局部微环境变化可能导致具有不同有效反应性的酯基团，使得在所研究的条件下完全水解在动力学上无法实现。

与这些发现一致，图 8 比较了从未水解聚合物以及使用微波辅助水解反应（图 8a）和标准加热系统（图 8b）的样品在不同反应时长下获得的产物的 FTIR 光谱结果。对于微波辅助反应，观察到与酯水解相关的羰基伸缩峰在 1500 cm^-1左右，对于 4 小时和 8 小时的样品都是如此。然而，对于 8 小时的反应，检测到 1700 cm^-1附近的酯相关信号强度显著降低，表明酯键随时间而断裂。因此，IR 分析证实了 NMR 光谱获得的结果，验证了延长反应时间的有益效果。关于油浴中进行的反应，未水解聚合物的光谱在 2800–3000 cm^-1附近表现出 CH₂和 CH₃伸缩振动，这是 P(PEGMA) 的亚甲基和甲基基团的典型频率。此外，仍然可以观察到指示酯基团的 C–O–C 伸缩峰，大约在 1700 cm^-1。与 NMR 数据一致，水解产物与原始聚合物相比变化极小。

3.5. 通过 SEC 进行聚合物表征

如第 3.1 节所述，合成了不同分子量的 PGMA_m样品（表 1），包括用于研究微波和常规加热下水解动力学的 PGMA₁₁₂。这些聚合物被用作测定所研究水解聚合物分子量的校准标准品。原始聚合物最初使用以 DMAc 为洗脱液的 SEC 系统进行表征。分析证实聚合物具有预期的分子量和窄多分散性（?_SEC< 1.3），与 ATRP 受控聚合的特性一致。它们的表征数据在表 1 中报告。通过 SEC 测定的分子量与通过 ¹H-NMR 计算的分子量之间的微小差异归因于 SEC 系统的固有局限性和使用聚苯乙烯校准标准品。尽管如此，偏差未超过 1.2 倍。用作标准的四个 PGMA 样品的 DMAc SEC 分析所得的色谱图如图 9a 所示。正如预期，分子量的增加对应于保留时间的减少，清晰地说明了在所用色谱系统中这两个变量之间的反比关系。

该系列 PGMA_m样品使用第 3.2 节中描述的优化 MAH 方案进行水解，采用微波加热 1 小时（实现完全水解所需的最短时间）。所得聚合物通过水性 SEC（ASEC）进行分析，使用磷酸盐缓冲的 NaNO₃溶液（pH 7）作为流动相。从 ASEC 色谱图（图 9b）中，得出了每个样品对应的保留时间。图 9c 将水解后 PGMA_m聚合物的预期分子量（以及 DP）的对数（基于相应未水解样品的 ¹H-NMR 分析）与其 ASEC 记录的实际保留时间相关联。正如预期，观察到线性关系，与典型的 SEC 校准曲线一致。类似地，水解后的 LYS-PGMA₁₀₉偶联物（通过 1 小时 MAH 在 3 M NaOH 中获得）和约 90% 水解的 P(PEGMA)₂₄₅聚合物（在 6 M NaOH 溶液中微波加热 14 小时后）也通过 ASEC 进行了分析。这些样品获得的保留时间与 log(DP_NMR) 和 log(M_{n,HYDRO NMR}) 表现出相同的线性相关性，正如先前在 PGMA_m样品系列中观察到的。值得注意的是，在图 9c 中，对应于 LYS-PGMA₁₀₉和 P(PEGMA)₂₄₅样品的红色和蓝色点恰好落在由 PGMA_m系列定义的同一趋势线上。这些结果表明，具有预定聚合度的水解聚合物可以作为有效的校准品，用于测定水