《Entomologia Experimentalis et Applicata》：Molecular Phylogeny and Strain Genotyping of the Bacterial Endosymbiont Wolbachia Associated With Tuta absoluta Populations
编辑推荐：
本文是一项针对入侵性害虫番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)的深入研究。作者对来自印度10个地区的种群进行了筛查，发现其普遍感染共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)，感染率高达42.8%–91.7%，而其他常见共生菌(Arsenophonus, Cardinium, Spiroplasma)则未检出。通过多位点序列分型(MLST)和wsp基因分析，鉴定出两种优势菌株序列型(ST41和ST367)，分别属于沃尔巴克氏体的B和A超群。研究发现，番茄潜叶蛾体内沃尔巴克氏体的高流行率和低遗传多样性，为未来开发基于沃尔巴克氏体的害虫生物防控策略提供了关键的分子依据和潜在的应用前景。
引言
番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)，又名Phthorimaea absoluta，是一种对番茄和其他茄科植物危害严重的经济入侵害虫，原产于南美洲，现已扩散至全球多地，包括印度。该害虫繁殖能力强，已对多种常用杀虫剂产生抗性，因此开发环境友好型的综合治理策略至关重要。昆虫不育技术(SIT)和遗传不育技术(IS)是行之有效的害虫防治方法。此外，昆虫体内的细胞内共生细菌，如沃尔巴克氏体(Wolbachia)，能够诱导宿主的生殖调控，例如导致细胞质不亲和性(CI)，即被感染的雄性与未感染的雌性交配后后代无法存活，这为害虫管理提供了新思路。沃尔巴克氏体是阿尔法变形菌纲的一种母系遗传的胞内共生菌，在昆虫中感染广泛，能通过多种机制（如雌性化、孤雌生殖、杀雄作用和CI）调控宿主生殖。基于多位点序列分型(MLST)和wsp基因等分子标记，已鉴定出多个沃尔巴克氏体超群，其中A和B超群在节肢动物中最为常见。本研究旨在调查印度番茄潜叶蛾自然种群中多种生殖共生菌的感染情况，并重点对检出的沃尔巴克氏体进行菌株分型和系统发育分析，以期为其生物防治应用奠定基础。
材料与方法
研究于2017年至2019年间，在印度6个邦的10个地点及一个实验室种群中采集了番茄潜叶蛾雄性成虫样本。样本通过信息素诱捕器收集，并采用CTAB法提取个体基因组DNA。首先，使用针对16S rRNA基因的特异性引物，通过PCR检测样本是否感染四种常见的生殖共生菌：Arsenophonus、Cardinium、Spiroplasma和Wolbachia。同时，通过扩增线粒体12S rRNA基因和细胞色素c氧化酶亚基I(mtCOI)基因来确保DNA质量和鉴定宿主物种。
对于沃尔巴克氏体阳性的样本，进一步采用MLST方法进行菌株分型。MLST分析基于五个看家基因：gatB、coxA、hcpA、ftsZ和fbpA，以及Wolbachia表面蛋白基因(wsp)。所有PCR产物经纯化后进行双向测序，获得的序列提交至GenBank。利用ClustalW进行序列比对，并通过贝叶斯推断法构建系统发育树。使用Brugia malayi（一种丝虫）的序列作为外群，以确定沃尔巴克氏体菌株所属的超群。感染率数据进行了统计学分析（单因素方差分析和卡方检验）。
结果
3.1 生殖共生菌的流行情况
在筛查的126个样本（116个野外样本和10个实验室样本）中，未检测到Arsenophonus、Cardinium和Spiroplasma的感染。然而，沃尔巴克氏体感染广泛存在，感染率在不同种群间存在显著差异，范围在42.8%至91.7%之间。感染率最高的地区是哈里亚纳邦的希萨尔(91.7%)，其次是特伦甘纳邦的马哈布卜纳加尔(85.7%)，马哈拉施特拉邦的纳西克和卡纳塔克邦的赖丘尔均为83.3%。感染率最低的地区是卡纳塔克邦的卡勒布勒吉(42.8%)和泰米尔纳德邦的哥印拜陀(50.0%)。
3.2 基于MLST/wsp的沃尔巴克氏体菌株分型
对沃尔巴克氏体阳性样本的MLST和wsp基因分析显示，除卡勒布勒吉地区的一个样本外，所有其他样本（包括实验室种群）均携带相同的优势菌株序列型——ST41，其MLST等位基因组合（gatB-39， coxA-14， hcpA-40， ftsZ-36， fbpA-4）和wsp等位基因（等位基因10）完全一致。然而，来自卡勒布勒吉地区的一个样本(TaK2)显示出一个新的序列型——ST367，其MLST等位基因组合（gatB-3， coxA-194， hcpA-222， ftsZ-171， fbpA-3）和wsp等位基因（等位基因427）均与ST41不同，其wsp高变区(HVR)模式也相异。
3.3 系统发育分析
基于16S rRNA基因、串联的MLST基因以及wsp基因序列构建的系统发育树表明，本研究中番茄潜叶蛾感染的沃尔巴克氏体菌株归属于两个超群。携带ST41的菌株全部聚集在超群B中，该超群包含来自鳞翅目、双翅目、鞘翅目和直翅目等多种昆虫的沃尔巴克氏体菌株。而携带ST367的菌株（来自卡勒布勒吉的TaK2）则归属于超群A，该超群也包含来自多种昆虫的菌株。
讨论
本研究证实，在印度的番茄潜叶蛾种群中，沃尔巴克氏体是唯一被检出的常见生殖共生菌，这与来自克罗地亚、伊朗、土耳其和阿根廷等地的研究结果一致，说明Arsenophonus、Cardinium和Spiroplasma可能并非该害虫的常见共生伙伴。沃尔巴克氏体的感染率呈现显著的地理变异，可能与宿主种群遗传、环境因素或采样时间有关。
系统发育分析结果表明，印度番茄潜叶蛾种群主要感染属于超群B的沃尔巴克氏体ST41菌株，这与来自巴西、南非和阿根廷的报道相符，表明该菌株可能是全球番茄潜叶蛾种群中一个广泛传播且保守的优势谱系。然而，在印度南部卡勒布勒吉地区发现的一个样本感染了属于超群A的新序列型ST367，这提示了沃尔巴克氏体菌株在局部可能存在多样性。这种多样性可能源于水平转移事件，例如通过寄生蜂或其他生态相互作用在不同昆虫宿主间传播。
沃尔巴克氏体在番茄潜叶蛾中能诱导细胞质不亲和性(CI)，但不会导致孤雌生殖。其高感染率和相对较低的遗传多样性（主要围绕ST41）是一个有利因素，因为这意味着基于单一优势沃尔巴克氏体菌株来开发种群压制策略（如利用CI效应）可能具有更高的可行性和效率。通过释放感染特定沃尔巴克氏体菌株的雄性昆虫，可以与野外未感染或感染不同菌株的雌性产生CI，从而降低害虫种群数量。
结论
综上所述，本研究首次对印度番茄潜叶蛾种群的生殖内共生菌进行了系统性调查和分子特征分析。结果表明，沃尔巴克氏体（主要为ST41型）是该害虫种群中高度流行且占主导地位的共生菌，而其他共生菌则未被发现。发现了一个新的ST367型菌株，丰富了我们对沃尔巴克氏体在该害虫中多样性的认知。这些发现为了解番茄潜叶蛾与共生微生物的互作关系提供了重要数据，并凸显了利用沃尔巴克氏体介导的细胞质不亲和性(CI)作为一种环境友好的、有潜力的生物防治工具来管理这一全球性重大害虫的可能性。未来的研究需要进一步评估这些菌株诱导CI的强度，并探索将其与昆虫不育技术(SIT)相结合的综合治理策略。
