《Journal of Biological Chemistry》：Single-Cell Insights into Cisplatin Resistance Mechanisms in Bladder Cancer Tumor Microenvironment
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本文聚焦膀胱癌（BC）顺铂耐药机制这一临床难题。研究团队整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与体外实验，系统解析了肿瘤微环境（TME）的细胞异质性及其驱动耐药的分子机制。研究发现并鉴定了关键的耐药上皮细胞（Epi_cisplatin_res）和成纤维细胞（Fib_cisplatin_res）亚群，揭示了其特有的代谢重塑（如糖酵解、DNA损伤修复增强）和细胞间通讯（MIF等信号通路激活）特征。验证实验证实SPINK1基因通过MIF信号轴在耐药中发挥核心作用。该研究为克服膀胱癌顺铂耐药、开发新的治疗靶点提供了重要的理论依据和潜在干预策略。
在人类对抗癌症的漫长战役中，化疗药物顺铂（cisplatin）曾被誉为对抗多种实体瘤的“王牌武器”，对于膀胱癌（Bladder Cancer, BC）的治疗更是金标准方案。然而，这张“王牌”却有一个令人头疼的弱点——耐药性。许多患者在接受初期有效治疗后，会不可避免地出现疾病进展和复发，导致生存率和生活质量大幅下降。这背后究竟隐藏着怎样的“反制机制”？传统的群体水平研究如同观察一片森林，虽然能看到整体变化，却难以分辨其中每一棵树木的独特状态和它们之间错综复杂的交流网络。因此，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）这个由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞等多种角色构成的复杂“生态系统”，尤其是其内部的细胞异质性和动态互动如何共同导演了这场耐药“大戏”，长期以来是肿瘤研究领域亟待破解的谜题。
为了精准解码这一谜题，来自安徽医科大学第二附属医院泌尿外科的研究团队Linfei Xu、Yongfeng Lin、Guanyun Shi、Liming Zhang、Xingzhang Lin和Tao Zhang在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项开创性研究。他们巧妙地结合了前沿的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术与传统的体外功能验证，如同一台高精度显微镜，首次在单细胞分辨率下，系统描绘了膀胱癌顺铂耐药过程中TME的细胞图谱，并揭示了驱动耐药的关键分子开关和细胞通讯网络。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，从公共基因表达综合（GEO）数据库获取了包括顺铂敏感、耐药、肿瘤及正常组织样本的单细胞RNA测序数据集。其次，利用Seurat、Harmony等生物信息学工具进行数据质控、批次校正、细胞聚类和注释，构建了膀胱癌的单细胞转录组图谱。再者，运用CellChat和CellPhoneDB工具深入分析了肿瘤微环境内的细胞间通讯网络。此外，通过scMetabolism工具分析了细胞的代谢活性，并使用Monocle软件进行了拟时间轨迹分析以追踪细胞的动态演变。最后，通过体外建立顺铂耐药膀胱癌细胞系（5637-R），并利用MTT实验、RT-qPCR、Western Blot以及细胞共培养等技术，对生物信息学发现的核心基因（如SPINK1）和信号通路（如MIF轴）进行了功能验证。
研究结果
膀胱癌单细胞转录组图谱的构建及耐药微环境中的细胞间通讯表征
研究人员通过整合分析多个数据集，成功构建了一个包含正常组织、肿瘤组织、顺铂敏感及耐药样本的统一单细胞图谱。他们鉴定了上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等多种细胞类型，并观察到在耐药样本中上皮细胞比例显著增加。细胞间通讯分析发现，与敏感组相比，耐药组细胞间的通讯数量和强度显著增强，尤其是上皮细胞与成纤维细胞、免疫细胞之间的互动异常活跃。其中，MIF、THBS、MHC-II和FN1等信号通路在耐药组中被显著激活。
顺铂耐药上皮细胞亚群的异质性鉴定及拟时间进化轨迹
通过对上皮细胞进行亚群分析，研究团队鉴定出一个特定的耐药亚群，并将其命名为Epi_cisplatin_res。该亚群在耐药样本中富集，并显示出高DNA损伤修复评分。差异基因分析发现，SPINK1、MKI67等基因在该亚群中高表达。功能富集分析表明，这些差异基因与脂肪酸代谢、p53信号通路、铂类药物耐药等通路密切相关。生存分析进一步证实，SPINK1、MKI67等高表达与肾上腺皮质癌（ACC）、肾透明细胞癌（KIRC）患者的不良预后相关。拟时间轨迹分析显示，Epi_cisplatin_res细胞处于分化轨迹的晚期，其转录因子表达谱（如CD44、SNAI2上调）暗示了与细胞增殖、迁移和耐药获得相关的动态演变过程。
顺铂耐药成纤维细胞亚群的分子特征、代谢重编程及发育动态
同样，在成纤维细胞中也鉴定出一个耐药相关亚群Fib_cisplatin_res。该亚群高表达PHGR1、FXYD3、SPINK1等基因。差异基因富集于粘着斑、PI3K-Akt信号、MAPK信号等与耐药相关的通路。代谢分析揭示，Fib_cisplatin_res细胞在糖酵解/糖异生、三羧酸（TCA）循环及细胞色素P450药物代谢途径中活性显著升高，表明其发生了深刻的代谢重编程以适应耐药。拟时间轨迹分析清晰地描绘了成纤维细胞从敏感状态向耐药状态（Fib_cisplatin_res）的动态转变过程，并识别出BRCA1、FXYD3、VIM等在此过程中表达发生关键变化的基因。
体外功能验证：SPINK1与MIF信号轴驱动膀胱癌顺铂耐药
为验证上述发现，研究人员成功建立了膀胱癌顺铂耐药细胞系5637-R。与亲本细胞相比，耐药细胞中SPINK1、PHGR1、APOD等基因的mRNA和蛋白水平均显著上调。当使用短发夹RNA（shRNA）敲低SPINK1后，耐药细胞的顺铂半数抑制浓度（IC50）显著降低，恢复了药物敏感性。机制上，SPINK1敲低导致MIF及其受体CD74的表达下调。进一步研究发现，耐药细胞中MIF-CD74信号轴及其下游的Akt、p65等通路被激活。更重要的是，在Transwell共培养体系中，耐药细胞能够通过分泌MIF增强巨噬细胞对顺铂的耐受性，而这种保护作用可被MIF抑制剂4-IPP所逆转。
研究结论与讨论
本研究通过整合单细胞组学与实验验证，首次在单细胞层面系统阐明了膀胱癌肿瘤微环境驱动顺铂耐药的细胞与分子全景图。核心结论在于：1）鉴定出具有独特分子特征的顺铂耐药上皮细胞（Epi_cisplatin_res）和成纤维细胞（Fib_cisplatin_res）亚群，它们是微环境中驱动耐药的关键力量；2）这些耐药亚群经历了显著的代谢重编程，包括增强的糖酵解、DNA损伤修复和药物代谢能力；3）耐药微环境中存在异常活跃的细胞间通讯网络，特别是以MIF为核心的信号通路在介导耐药细胞与免疫细胞、基质细胞的互作中扮演了枢纽角色；4）SPINK1被证实是位于MIF信号轴上方的关键驱动基因，其通过调控MIF-CD74轴不仅自身促进耐药，还能“教育”巨噬细胞形成保护性微环境。
该研究的重大意义在于，它将人们对膀胱癌顺铂耐药机制的理解从模糊的“群体现象”推进到了清晰的“单细胞地图”和“细胞社交网络”层面。它不仅揭示了以前被群体数据掩盖的耐药细胞异质性，还明确了代谢重塑和特定细胞间对话（如SPINK1-MIF轴）在耐药中的核心作用。这些发现为临床克服顺铂耐药提供了全新的思路和潜在的精准靶点：例如，针对SPINK1或MIF信号轴的抑制剂，或者干预耐药细胞特有的代谢通路（如糖酵解），有望成为逆转耐药、提高膀胱癌化疗疗效的新策略。尽管研究存在样本来源等局限性，但其构建的多维度分析框架和发现的分子靶标，无疑为未来开发更有效的膀胱癌治疗手段奠定了坚实的理论基础。
