《Journal of Biological Chemistry》：An Enhancement of Extrachromosomal Circular DNA Enrichment and Amplification to Address the Extremely Low Overlap Between Replicates
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为解决eccDNA研究中技术重复间检出重叠率极低(<1%)的问题，研究人员优化了Circle-seq方案，通过增加Exonuclease V活性、CRISPR-Cas9线粒体DNA线性化及优化滚环扩增(RCA)条件，成功将技术重复间eccDNA重叠率提升至>50%，并揭示了癌症细胞系中的致癌基因eccDNA特征，为标准化eccDNA分析提供了关键指导。
在我们细胞的“司令部”——细胞核内，除了大家熟知的、以线性形式存在的染色体DNA，还游荡着一群神秘的“自由民”——染色体外环状DNA（Extrachromosomal circular DNA, eccDNA）。它们是染色体起源的、共价闭合的环形DNA分子，大小从几百个碱基对到几兆碱基对不等，可以携带完整的基因、调控元件或重复序列。这些eccDNA的动态变化和表达与细胞生物学、遗传学以及多种疾病，尤其是癌症的发生发展密切相关，正成为一个越来越受关注的研究领域。
然而，深入研究eccDNA的道路上却横亘着一个巨大的谜团：极度低下的重叠率。无论是来自同一个组织的不同生物学重复样本，还是同一份样本的不同技术重复检测，研究人员发现，它们之间能检测到的、相同的eccDNA分子比例出奇地低，通常不到1%。这究竟是eccDNA在细胞间本就难以遗传，还是我们现有的检测技术存在根本缺陷，导致了这种“千差万别”的假象？这个谜团严重阻碍了我们对eccDNA生物学功能的认知，也让将其开发为稳定的疾病生物标志物或治疗靶点变得异常困难。为了解决这个难题，一个由Charles M. Burnham、Alongkorn Kurilung、Visanu Wanchai、Birgitte Regenberg、Jesus Delgado-Calle、Alexei G. Basnakian和Intawat Nookaew组成的研究团队开展了一项深入的研究，并成功将重复样本间的eccDNA重叠率从不到1%提升到了50%以上。他们的研究成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
研究人员主要采用了优化后的Circle-seq富集技术，结合基于CRISPR-Cas9的线粒体DNA（mtDNA）靶向线性化方法，以及针对滚环扩增（RCA）关键参数的优化。样本来源包括体外培养的人乳腺癌细胞系（HCC1143， HCC1395， AU565， SKBR3， MCF10A）和多发性骨髓瘤细胞系（OPM-2， JJN3），以及通过静脉注射OPM-2细胞构建的小鼠异种移植模型中的肿瘤组织。
DNA修复预处理有助于去除线性化mtDNA，促进环状DNA富集
研究人员首先优化了线性染色体DNA的去除步骤，将原需5天的过程缩短至约6小时，方法是每小时补充一次Exonuclease V（RecBCD）酶混合物。他们发现，在eccDNA富集前进行DNA修复酶预处理，可以更有效地去除线性DNA（包括线性化的mtDNA），使更多的测序读段用于构建eccDNA。整合了DNA修复步骤的优化方案，将总富集时间从186小时大幅缩短至15小时。
靶向mtDNA线性化的CRISPR-Cas9方法优于限制性内切酶
在线性DNA被Exonuclease V去除后，研究比较了使用PmeI限制性内切酶和CRISPR-Cas9两种方法线性化mtDNA的效果。结果显示，CRISPR-Cas9方法在有效去除mtDNA的同时，能更好地保留那些恰好含有PmeI或PacI酶切位点的eccDNA。一个关键发现是，含有这些酶切位点的eccDNA通常比不含位点的eccDNA更大，这与限制性内切酶在长DNA分子上更可能找到切点的概率预期一致。这提示，使用限制性内切酶去除mtDNA可能会无意中丢失掉更多、更长的eccDNA。
通过RCA引物滴定增加串联体读段生成，用于长读长序列高可信度重建eccDNA
滚环扩增产生的串联体（concatemer）读段是高质量、高可信度eccDNA重建的关键。研究人员假设，商业试剂盒推荐的标准随机六聚体引物浓度（50 μM）可能因引发过度分支化而抑制了串联体读段的生成。他们以JJN3细胞为模型，系统性地改变了起始基因组DNA（gDNA）输入量（1 μg和5 μg）和随机引物浓度。结果证实，较低的引物浓度（如2.5 μM）能持续增加串联体读段和来源于串联体的eccDNA（concatemer-derived eccDNA）的百分比。当使用1 μg gDNA和2.5 μM引物时，三个技术重复间共同来源的eccDNA重叠率达到约3.5%，相较于以往研究中普遍低于1%的报道是显著提升。此外，低输入、低引物浓度的条件使得eccDNA的检测更倾向于高丰度分子，并提高了eccDNA丰度与染色体基因密度之间的相关性。基于此，研究建议：若目标为捕获高丰度eccDNA，推荐使用1 μg gDNA和2.5 μM引物；若希望捕获更广泛的eccDNA多样性，则使用5 μg gDNA和5 μM引物。
案例研究1：培养和异种移植小鼠的OPM-2人多发性骨髓瘤细胞eccDNA分析
将优化方案应用于从异种移植小鼠胫骨提取的混合DNA（约含1 μg，包含人癌细胞和小鼠细胞）中分析人源eccDNA。在七个样本中，检测到的人源eccDNA密度（17-89 eccDNA/Mbp）显著高于体外培养实验。串联体读段占17%-30%，并贡献了63%-80%的eccDNA。虽然异种移植样本间的重叠率（平均成对重叠6.5%，七样本完全重叠0.19%）低于体外培养的OPM-2细胞（>20%），但研究仍成功鉴定出一些在所有样本中均存在的、携带特定基因（如ZEB1）的共有eccDNA。
案例研究2：人乳腺癌细胞中的eccDNA分析
研究人员分析了多个乳腺癌细胞系（HCC1143， HCC1395， AU565， SKBR3）和非癌性上皮细胞MCF10A。当使用早期未优化的方案（5 μg gDNA， 5 μM引物）时，生物学重复间的重叠率很低（<5%）。而在采用优化策略（结合技术重复，使用1 μg gDNA和2.5 μM引物）后，各细胞系三个生物学重复间的eccDNA重叠率显著提升（SKBR3为19.5%， HCC1395为30.1%， AU565为31.8%， MCF10A为42.2%， HC1143为43.4%）。这些eccDNA富含CpG岛、5‘UTR、外显子、内含子以及重复元件，表明其形成可能偏向于高转录活性区域，且微同源介导的机制参与其中。
在多发性骨髓瘤和乳腺癌中鉴定到的eccDNA的致癌基因特征
研究进一步分析了所有鉴定到的eccDNA是否携带来自COSMIC数据库的致癌基因。结果显示，在多个样本中，致癌基因在eccDNA上显著富集。例如，在多发性骨髓瘤细胞（OPM-2）中，无论是培养细胞还是异种移植样本，都高频、高深度地检测到携带致癌基因（如NOTCH1， PRDM16）的eccDNA。在乳腺癌细胞系中，SKBR3细胞携带的致癌基因eccDNA最多。值得注意的是，致癌基因PRDM16在多种细胞类型（多发性骨髓瘤和多个乳腺癌细胞系）的多个重复样本中均被检测到，提示其可能是一个跨癌种的、与eccDNA相关的关键因子。
结论与讨论
本研究通过系统优化eccDNA富集与扩增的关键步骤，成功将技术重复间的重叠率从以往报道的不足1%提升至50%以上，有力证明了实验方法学是导致以往eccDNA低重叠率现象的主要因素之一。优化主要包括：1）通过高频补充Exonuclease V大幅缩短线性DNA消化时间；2）采用CRISPR-Cas9替代限制性内切酶进行mtDNA线性化，避免因酶切位点而损失长eccDNA；3）精细调控RCA中的随机引物浓度和gDNA输入量，以最大化产生用于高可信度重建的串联体读段。这些优化不仅将整个流程缩短至8小时，更具临床转化潜力，而且使研究者能够根据研究目标（捕获广度 vs. 捕获丰度）灵活选择实验条件。
更重要的是，在高重叠率的基础上，研究能够在不同生物学重复中稳定地鉴定出共有的、携带致癌基因的eccDNA，这为eccDNA作为癌症驱动因子和潜在生物标志物的研究提供了坚实的技术基础。本研究揭示的eccDNA特征（如富含转录相关元件、与基因密度相关）也为理解其生物发生机制提供了线索。总之，这项工作为建立eccDNA研究的标准化流程提供了关键指导和实验依据，将极大地推动对eccDNA生物学功能及其在疾病中作用的深入理解。
