《Journal of Biological Chemistry》：Characterization of recombinant Arabidopsis FRIABLE1 (FRB1) reveals robust Rhamnogalacturonan-I Rhamnosyltransferase activity and critical catalytic residues.
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本研究针对植物细胞壁果胶RG-I合成关键酶鉴定与功能解析的难题，聚焦拟南芥FRIABLE1蛋白。研究人员通过开发新型大肠杆菌表达系统成功制备纯化FRB1，并结合AlphaFold3结构建模，系统表征了其鼠李糖基转移酶活性与动力学常数，鉴定出关键催化残基。这为深入理解植物GT106家族糖基转移酶的结构与功能，以及解析RG-I生物合成机制提供了新的方法与见解。
植物体被一层名为细胞壁的富含糖类的胞外基质所包裹，它不仅决定了细胞的形状，还深刻影响着植物的生长、发育以及对环境的适应。在这复杂的“建筑”中，果胶是重要的“砖石”之一，尤其是在双子叶植物和某些单子叶植物的初生壁中，果胶可占近三分之一的“建材”。鼠李半乳糖醛酸聚糖-I是果胶的关键结构域之一，其主链由重复的【半乳糖醛酸-鼠李糖】二糖单元构成。然而，长期以来，负责将这个主链“缝合”在一起的“工人”——即合成RG-I的糖基转移酶，大多身份不明或功能未明。这如同我们想建造一座建筑，却不知道关键的砌砖师傅是谁，极大地阻碍了我们对细胞壁合成乃至整个植物生命过程的深入理解。
拟南芥FRIABLE1蛋白正是这样一个充满谜团的候选“砌砖师傅”。早期遗传学研究表明，其编码基因的突变会导致幼苗下胚轴和子叶细胞粘连严重缺陷，暗示它可能参与合成与细胞粘附相关的细胞壁多糖。但关于其生化功能，学界存在争议：是参与RG-I合成，还是作用于木葡聚糖，或是一种潜在的蛋白O-岩藻糖基转移酶？一项近期研究提供了FRB1具有RG-I鼠李糖基转移酶活性的初步证据，但其酶学特性的精准描绘，以及催化机制的关键残基，仍需在获得纯化蛋白的基础上进行严谨的确认与探索。这项发表在《Journal of Biological Chemistry》上的研究，正是为了解开FRB1蛋白的真实生化功能之谜，并通过结构模型来窥探其催化中心的奥秘。
为了回答这些问题，研究人员运用了一系列关键技术方法。首先，他们构建了截短形式的FRB1蛋白，利用大肠杆菌RosettaGami2表达系统，成功实现了该重组蛋白的可溶性表达，并通过镍亲和层析与直链淀粉亲和层析两步法，实现了蛋白的纯化。其次，他们以从拟南芥种皮粘液中提取并标记的RG-I寡糖为受体底物，通过UDP-Glo检测法，对纯化后的FRB1进行了酶活性、底物特异性、动力学参数（KM、Kcat）及金属离子依赖性的系统表征。接着，研究人员利用AlphaFold3工具，为FRB1的糖基转移酶结构域构建了高置信度的三维结构模型，并模拟了与底物UDP-鼠李糖的分子对接，从而预测了潜在的催化关键残基。基于此模型预测，他们通过定点诱变技术，构建了一系列突变体蛋白，并测定了其酶活性，以验证这些残基的功能。最后，他们与在HEK293细胞中表达并纯化的RG-I半乳糖醛酸基转移酶1协同作用，在体外进行了RG-I多聚化的功能重建实验，并通过聚丙烯酰胺糖电泳分析了产物大小。
研究结果
重组AtFRB1的表达与活性表征
研究人员成功在大肠杆菌RosettaGami2细胞中表达了N端融合麦芽糖结合蛋白、C端带有6×His标签的截短FRB1蛋白，并纯化至接近均一。质谱鉴定和分子质量测定证实了蛋白的正确性及其单体状态。酶学分析表明，该重组蛋白显示出对UDP-鼠李糖和RG-I寡糖的特异性依赖，而对UDP-葡萄糖或寡聚半乳糖醛酸无活性，活性不依赖于镁或锰离子。动力学分析得到其表观KM值：对UDP-鼠李糖为226 μM，对RG-I寡糖为117 μM；表观Kcat值分别为33 min-1和28.7 min-1。质谱分析证实反应产物质量增加146 Da，对应于一个鼠李糖残基的加成。
鉴定FRB1催化的氨基酸
由于缺乏GT106家族的实验结构，研究人员将FRB1与已知结构的线虫蛋白O-岩藻糖基转移酶进行比对，并利用AlphaFold3构建了FRB1糖基转移酶结构域与UDP-鼠李糖对接的模型。模型显示，FRB1的R386、D390、M391和Q230等残基与UDP-鼠李糖的磷酸基团或糖环形成相互作用，与POFUT1酶中关键催化残基的作用模式相似。通过定点突变和酶活测定，研究人员发现Q230A、R386A、D390E突变几乎完全丧失了酶活性，Q230N突变也失活，M391A突变则保留了约20%的活性，表明这些残基对FRB1的催化至关重要。
FRB1与RGGAT1的活性协同
为了验证FRB1在RG-I多聚体合成中的功能，研究人员将其与RGGAT1在体外共孵育。结果显示，在供体与受体比例为2000:1的高浓度下，FRB1与RGGAT1能够协同作用，将起始的DP12寡糖延伸为长度显著增加的多聚物，其大小更接近于天然的拟南芥种皮粘液RG-I。
研究结论与意义
本研究成功开发并利用了一个稳健的大肠杆菌表达系统，首次实现了拟南芥FRIABLE1蛋白的高效重组表达与纯化，并对其进行了详尽的酶学表征。研究明确证实了FRB1是一个单体、金属离子非依赖性的、高特异性的RG-I鼠李糖基转移酶。通过结合AlphaFold3结构建模预测和定点诱变功能验证，研究揭示了Q230、R386、D390和M391是FRB1催化活性的关键残基，阐明了其催化机制的分子基础。更重要的是，研究证明FRB1能够与RGGAT1协同工作，在体外高效合成长度与天然产物更为接近的RG-I多聚体。
这项研究的意义在于多个层面。在技术层面，它展示了一种结合AI结构预测工具与稳健原核表达系统来研究难表达真核糖基转移酶的有效策略，为同类研究提供了新方法。在基础科学层面，它不仅解决了关于FRB1生化功能的长期争议，确认了其作为RG-I合成酶的角色，为理解植物细胞壁果胶的生物合成机制增添了关键一环，而且通过鉴定关键催化残基，为理解GT106家族乃至更广泛的植物糖基转移酶的结构与功能关系提供了宝贵线索。这些发现将有助于未来通过遗传工程手段调控细胞壁性质，为改善作物性状和开发基于植物多糖的生物材料奠定理论基础。
