《Journal of Biological Chemistry》：Phosphorylation of inner core heptose is a major determinant of bacterial surface lipopolysaccharide recognition by the innate immune protein hSP-D
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本研究为阐明先天免疫蛋白人表面活性蛋白D (hSP-D)识别革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)的分子机制，解决了因酸水解破坏天然LPS结构无法完整观察关键识别位点的问题。研究人员通过高分辨率晶体学解析了hSP-D与多种合成LPS内核心寡糖（包括磷酸化庚糖）的复合物结构，首次直观揭示了庚糖磷酸化是影响hSP-D识别和细菌免疫逃逸的核心因素，对理解宿主-病原体互作及开发相关疗法有重要意义。
在我们的身体里，有一支时刻待命的“先天免疫部队”，它们不依赖特异性记忆，而是通过识别病原体表面的保守“分子标签”来快速启动防御。人表面活性蛋白D (human Surfactant Protein D, hSP-D)就是这样一位重要的“哨兵”，它属于凝集素家族，在肺部及其他黏膜表面巡逻，专门识别并结合病原体表面的碳水化合物结构。对于革兰氏阴性菌而言，其标志性的表面分子——脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)——就是hSP-D的主要目标。hSP-D通过其碳水化合物识别结构域(Carbohydrate Recognition Domain, CRD)，以钙离子依赖的方式，优先结合LPS内核心区域的第一个庚糖(HepI)。理解这种精准识别的细节，对于揭示机体如何抵御细菌入侵以及细菌如何狡猾地逃避监视至关重要。
然而，通往真相的道路上布满荆棘。过去的研究为了获得可供结晶的LPS核心寡糖，通常采用乙酸水解的方法从细菌中提取。这个方法虽然有效，却像一把粗暴的剪刀，在剪开目标的同时，也破坏了关键的特征：它常常会切除连接在核心糖上的磷酸基团等官能团，并将核心的3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid, Kdo)残基重组成一种五元呋喃衍生物（脱水-Kdo）。这样一来，研究者们就无法观察到hSP-D与完整、天然的Kdo以及磷酸化修饰的庚糖是如何相互作用的。这留下了一个关键的科学盲区：磷酸化修饰究竟在hSP-D的识别中扮演什么角色？它是增强了结合，还是帮助细菌实现了“隐身”？
为了拨开这层迷雾，Harry M. Williams、Alastair Watson、Jens Madsen、Howard W. Clark、Derek W. Hood、Stefan Oscarson、Trevor J. Greenhough和Annette K. Shrive组成的研究团队进行了一项精巧的研究。他们不再使用从细菌中酸水解得到的、有缺陷的天然LPS片段，而是转向了化学合成的高度纯化的寡糖。这些合成分子精确模拟了流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)等许多革兰氏阴性菌LPS内核心的关键结构单元。具体包括：庚糖I-(1,5)-KdoI二糖、庚糖III-(1,2)-庚糖II-(1,3)-庚糖I三糖，以及分别在庚糖I或庚糖II的O4′位点磷酸化的两种庚糖II-(1,3)-庚糖I二糖。利用这些“完美”的分子探针，研究人员得以首次在原子分辨率水平上，直观地“看到”hSP-D的三聚体重组片段(trimeric recombinant fragment of hSP-D, rfhSP-D)是如何与这些核心结构，特别是磷酸化形式，进行结合的。这项研究的结果发表在了《Journal of Biological Chemistry》上。
为了开展这项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，利用大肠杆菌表达系统克隆、表达并纯化了具有生物活性的rfhSP-D蛋白。其次，通过化学方法合成了四种精确对应目标LPS内核心结构的寡糖配体。最后，也是最主要的技术，是蛋白质X射线晶体学。研究人员将合成的寡糖配体通过“浸泡法”引入到天然rfhSP-D的晶体中，然后分别收集了四个复合物（对应四种配体）的高分辨率衍射数据（分辨率在1.63 ?到1.92 ?之间），并通过分子置换和迭代精修，最终解析出了高精度的三维晶体结构，从而直接观察蛋白质与配体之间的相互作用细节。
研究结果
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配体与复合物结构概览
研究人员成功解析了rfhSP-D与四种合成寡糖复合物的高分辨率晶体结构。在每种结构中，配体均结合在rfhSP-D三聚体中两个亚基（B和C）的Ca1结合口袋，而第三个亚基（A）由于晶体堆积紧密而未结合配体，这与之前的研究观察一致。不同配体在电子密度图中的可见程度因其与蛋白质的相互作用而异。
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hSP-D优先通过HepI的O6′/O7′识别核心
对于HepI-(1,5)-KdoI二糖、HepIII-HepII-HepI三糖以及磷酸在HepII上的PhosII-4-HepII-HepI二糖，识别模式是统一的：配体通过HepI侧链的O6′和O7′羟基与Ca1离子及其周围的保守氨基酸（Glu321、Asn323、Glu329和Asn341）配位结合。值得注意的是，在HepI-(1,5)-KdoI的结构中，电子密度只清晰地显示了HepI，而连接在其上的KdoI残基及其间隔基均不可见，这表明单个Kdo残基本身对hSP-D的配体识别没有显著贡献。这一发现支持了此前糖阵列和表面等离子体共振的结合数据。
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HepI磷酸化迫使hSP-D采用替代识别模式
当磷酸基团连接在HepI的O4′位时（即HepII-HepI-4-PhosI配体），情况发生了根本性改变。此时，配体不再通过优先的HepI O6′/O7′对结合，因为磷酸基团会与蛋白质表面发生不利的空间冲突。相反，hSP-D表现出了惊人的灵活性，转而通过HepII吡喃环上的O3′和O4′羟基与Ca1结合口袋结合。这是首次在结构上定义人类凝集素分子与磷酸化寡糖的复合物。
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磷酸化是决定识别与逃逸的关键因素
磷酸化修饰在此被证明是影响hSP-D识别的核心决定因素。HepI的O4′磷酸化会直接阻碍其通过O6′/O7′这一首选方式进行结合。在HepII-HepI-4-PhosI的结构中，除了钙离子配位，配体还通过结合口袋侧翼的关键残基Arg343和Asp325与蛋白质产生了额外的直接相互作用，其中Arg343同时与HepII的O2′羟基和HepI上的磷酸基团形成氢键。这些相互作用稳定了这种替代结合模式。
研究结论与意义
本研究通过高分辨率结构生物学手段，清晰揭示了先天免疫蛋白hSP-D识别细菌LPS内核心的精细分子蓝图，并首次明确了庚糖磷酸化在此过程中的核心作用。
核心结论是，hSP-D识别LPS具有层次性和灵活性：其最优先的模式是结合内核心还原末端的庚糖I (HepI) 的O6′/O7′羟基对；与其α1-3连接的庚糖II (HepII)或单个Kdo残基对识别没有直接影响。然而，当这种首选表位因化学修饰而无法利用时，hSP-D能够灵活地采用替代结合模式，例如结合HepII的O3′/O4′羟基对，或如先前研究所揭示的结合末端葡萄糖。
本研究的突破性发现在于，首次从结构上证明庚糖的磷酸化是决定hSP-D识别或细菌免疫逃逸的一个主要因素。具体而言，HepI的O4′磷酸化会通过空间位阻效应，主动“屏蔽”掉hSP-D首选的HepI结合位点。在仅核心骨架存在的情况下（如本研究使用的合成二糖），hSP-D可以通过结合HepII来克服这一屏蔽。然而，在天然、更复杂的LPS结构中（如肠道沙门氏菌Ra表型），HepII的O3′位通常连接有长长的外核心寡糖链，这会同时阻断通过HepII的替代结合途径。因此，在HepI和HepII均被磷酸化且HepII连接有外核心链的完整LPS中，hSP-D的识别将被有效阻断。
这一发现具有重要的生物学意义。它阐明了一种细菌潜在的免疫逃逸机制：通过对其LPS内核心庚糖进行磷酸化修饰，细菌可以有效地将自己“隐藏”起来，躲避像hSP-D这样的先天免疫哨兵的侦察。LPS磷酸化是革兰氏阴性菌中普遍存在的现象，这可能代表了细菌在与宿主共栖和致病过程中演化出的一种通用免疫规避策略。该研究不仅深化了我们对宿主-病原体相互作用分子基础的理解，也为未来针对肺部感染等疾病的免疫干预策略提供了新的潜在靶点和思路。
