表面性质调控：自组装单分子层对金电极固定L-乳酸氧化酶活性与稳定性的影响机制研究

《Journal of Biotechnology》：Surface property effects in the immobilization of L-lactate oxidase on gold electrodes by self-assembled monolayers

推荐：为提升酶电极在生物传感中的性能，研究人员针对L-乳酸氧化酶(His-LOx)在金电极上的固定化策略开展了研究。通过设计亲水、疏水及Ni2+螯合等不同表面性质的自组装单分子层(SAMs)，系统考察了酶与电极界面的相互作用。结果表明，亲水性1-硫代甘油(TG)SAM可获得最高初始活性(10.5 μA/cm2)，而Ni2+络合的氮川三乙酸(Ni-NTA)SAM则显著提升了酶的操作稳定性(20小时后活性保持>65%)。研究揭示了SAM表面性质如何协同调控固定化酶的活性和稳定性，为设计高性能LOx生物传感器提供了关键依据。

　　

生物传感器在我们生活中扮演着越来越重要的角色，从血糖监测到环境污染物检测，都离不开它们。而酶电极是生物传感器的核心部件，其性能优劣直接决定了传感器的灵敏度、稳定性和使用寿命。然而，如何将具有生物催化功能的酶稳固且高效地固定在导电的电极表面，同时最大程度地保持其天然活性，一直是该领域面临的一大挑战。简单地将酶“粘”在电极上往往会导致酶失活或轻易脱落，使得传感器性能迅速衰减。为了解决这一难题，科学家们常常借助自组装单分子层(Self-Assembled Monolayers, SAMs)这一精巧的“分子胶水”来修饰电极表面，以期创造一个对酶更友好的微环境。但SAMs的表面特性，如亲疏水性、电荷以及是否存在特异性结合位点，究竟如何影响固定化酶的命运，其背后的作用机制仍不够明晰。

为此，来自格拉茨工业大学的Lara Marie Novak、Elisabeth Hengge、Mislav Su?ac、Roland Würschum和Bernd Nidetzky团队在《Journal of Biotechnology》上发表了一项研究，他们以带有N端His标签的L-乳酸氧化酶(His-LOx)为模型酶，系统探究了不同表面性质的SAMs对酶在金电极上固定化效果的影响。他们设计了多种SAMs，包括亲水性的1-硫代甘油(TG)、疏水性的1-辛硫醇(OT)、带负电荷的2-巯基乙磺酸钠(MESA)、以及能特异性螯合Ni²⁺从而结合His标签的氮川三乙酸衍生物(Ni-NTA)。研究目标非常明确：找到能够同时赋予固定化酶高活性和长期稳定性的最佳表面化学策略。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：电极制备与SAM修饰：使用金丝作为工作电极，通过浸泡法在表面组装不同种类的SAMs，对于Ni-NTA SAM还需进行Ni²⁺络合。酶固定化：将SAM修饰后的电极浸入含有His-LOx或野生型LOx(LOx-wt)的溶液中，通过物理吸附或特异性亲和力实现酶的固定。电化学活性与稳定性评估：采用计时电流法(Chronoamperometry, CA)在固定电位下检测酶催化L-乳酸产生H₂O₂的氧化电流，从而量化酶活性；并通过比较储存约24小时前后的活性变化来评估操作稳定性。

3.1. 用于LOx固定化的各种SAMs的选择

研究选取了五种SAM前体分子，旨在提供不同的表面特性：Ni-NTA用于His标签的特异性亲和结合；TG提供亲水性表面；OT作为疏水性对照；MESA提供带负电荷的表面；而10-氨基-1-癸硫醇(ADT)则提供胺基功能化表面。这些选择基于前期研究和文献依据，旨在系统比较不同相互作用对酶固定化的影响。

3.2. 不同SAMs上LOx的活性和稳定性

电化学活性测定显示，不同SAMs对His-LOx的初始活性影响显著。亲水性的TG SAM支持了最高的初始活性(10.5 μA/cm²)，约为Ni-NTA和MESA的5倍，ADT的10倍。疏水性的OT SAM导致了最低的酶活性，研究人员分析这可能是由于疏水环境不利于保持酶的天然构象，甚至可能引发酶疏水核心的展开。在操作稳定性方面，结果出现了有趣的“分野”：虽然TG SAM初始活性高，但其固定化的酶在储存约24小时后，活性下降到不足初始值的20%。与之形成鲜明对比的是，Ni-NTA SAM固定化的His-LOx表现出卓越的稳定性，24小时后仍能保留超过65%的活性。这一稳定性的提升被明确归因于Ni²⁺与His标签之间强大的特异性亲和结合。而当使用不带His标签的野生型LOx(LOx-wt)时，Ni-NTA SAM并未表现出稳定性优势，这进一步证实了特异性亲和结合的关键作用。

3.3. 混合SAMs上LOx的活性和稳定性

为了兼得TG的高活性和Ni-NTA的高稳定性，研究人员尝试将两者以不同摩尔比例混合，构建混合SAMs。结果发现了一种协同效应：某些比例的混合SAMs(如Ni-NTA:TG = 10:1)不仅继承了Ni-NTA的良好稳定性，其初始活性甚至超过了纯TG SAM，最高可达约13 μA/cm²。这表明亲水环境和特异性亲和结合可以协同优化酶的固定化状态。研究还尝试了Ni-NTA与ADT或OT的混合。Ni-NTA/ADT混合也观察到了活性的提升，而Ni-NTA/OT混合则由于引入了额外的疏水性，未能改善性能。稳定性测试表明，混合SAMs的稳定性主要由其中Ni-NTA的比例决定：当Ni-NTA的比例等于或高于另一组分时，酶电极能保持约60%的活性，接近纯Ni-NTA的水平；当另一组分(如TG或ADT)占主导时，稳定性则趋向于该组分的特性(即快速下降)。

结论与讨论

本研究清晰地揭示，通过精心设计和组合SAMs的表面性质，可以系统地调控酶电极的性能。亲水性有利于维持酶的高催化活性，而基于His标签与Ni-NTA的特异性亲和结合则是实现长期稳定性的关键。尤为重要的是，将两者结合的混合SAMs策略能够产生协同效应，同时实现高活性和高稳定性，这为理性设计高性能酶电极提供了明确的指导原则。文中也讨论了活性损失的可能机制，除了酶解吸附，施加的检测电位(550 mV)可能导致SAM-酶复合物发生氧化脱附，未来可通过优化电位或使用具有更高电催化活性的纳米多孔金(npAu)载体来进一步改善。总之，这项工作不仅增进了对酶-表面相互作用机制的理解，而且为开发用于乳酸检测等生物传感应用的稳健、灵敏的LOx电极提供了实用的设计原则。