《Journal of Biotechnology》：High-Yield and Simple Production of a Ferritin-tagged Urate oxidase with Enhanced Catalytic Stability and Yield
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通过融合人类 ferritin 与耐辐射奇球菌的尿酸氧化酶（DrUox），成功开发出高纯度（98%）、高产（890 mg/L）且稳定性显著提升的 24 聚体 DrUox-F。该融合蛋白在 pH 10 环境下保持 100% 活性达 35 天，半衰期通过甘露醇稳定剂延长 40 倍（41 h→1880 h），并具备室温 lyophilized 形态长期稳定性（280 天后活性保留 >90%）。
余峰|杨春|葛慧华|张瑞芳|陈亚欣|周艳红|吴志成|周登|李洪春|张光亚
华侨大学生物工程与生物技术系，中国福建省厦门市361021
摘要
尿酸氧化酶（Uox）在生物技术领域具有巨大潜力。然而，探索具有优异稳定性的Uox及其简单高效制备方法仍然具有挑战性。通过将人铁蛋白与极端微生物Deinococcus radiodurans中的Uox融合，获得了一种新型的24聚体Uox（DrUox-F），其性能优异。通过低速离心法获得的DrUox-F纯度达到98%，产率为890 mg/L，是目前报道的最高产率。值得注意的是，DrUox-F在pH 10条件下储存35天后仍保持100%的活性，显著优于DrUox。此外，在4°C下储存318天后也未观察到活性损失。冻干后的DrUox-F在室温下储存280天后仍保留了超过90%的原始活性。通过添加甘露醇作为外源稳定剂，其半衰期延长了约40倍（从41小时延长至1880小时）。分子对接结果显示，甘露醇能够特异性结合DrUox-F的多个位点，主要通过氢键相互作用。因此，DrUox-F具有优异的成本效益、高效率和增强的稳定性，为解决Uox的关键问题提供了突破性方案。
引言
尿酸是嘌呤代谢的最终产物，微溶于水且容易结晶（Roman, 2023）。在人体中，如果尿酸水平长期处于较高水平，可能导致高尿酸血症（Burnier, 2023）。长期的高尿酸血症会促进尿酸在关节、肾脏等器官中的积累，引发痛风并加重炎症性疾病，如心血管疾病和肾脏疾病（Schlesinger和Kaufmann, 2025; Borghi等, 2020）。调查显示，全球高尿酸血症的患病率逐年上升，预计到2030年将达到14.2亿例。中国的发病率高达13.3%，是仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病（Dehlin等, 2020）。
目前治疗痛风的主要策略是通过补充外源性尿酸酶或尿酸氧化酶（EC 1.7.3.3, Uox）来降低尿酸水平（Strilchuk等, 2019; Wei等, 2017）。Uox是一种关键酶，可催化尿酸氧化为高溶解度的所有醇、过氧化氢（H2O2）和二氧化碳（CO2）（Liu等, 2025）。Uox还可用作诊断酶，用于检测尿液和血液中的尿酸浓度（Schlesinger等, 2023）。第一种Uox是在牛的肾脏中发现的；此后，研究人员逐渐从不同来源分离并表征了Uox，包括Aspergillus flavus（Rahbar等, 2025）、Candida utilis（Liu等, 2011）、Microbacterium属（Kai等, 2008）和Bacillus subtilis（Pustake等, 2022）。由于从野生微生物中提取Uox的产率较低且纯化过程复杂，通常需要在宿主菌株（如酵母或E.coli）中异源表达以获得活性Uox（Tork等, 2020; Zhou等, 2025），虽然产率有所提高，但纯化成本仍然较高（Zhang等, 2023a）。此外，现有Uox的热稳定性较差且半衰期较短，进一步限制了其临床应用（Bao等, 2025）。
为提高Uox的热稳定性和半衰期，目前采用了以下三种方法：首先，通过融合稳定多肽结构域或与PEG化学偶联来增强其稳定性（例如，Zhang等, 2023b）。他们通过将IL-1Ra和白蛋白结合结构域（ABD）融合到Arthrobacter globiformis Uox（AgUox）的N端，显著延长了其体内半衰期并保持了抗炎活性。Tong等（Tong等, 2024）设计了一种靶向突变的人-猪嵌合Uox，并对其进行了PEG化处理，使其半衰期从10.5天延长至19.9天。其次，通过理性/半理性设计对Uox进行工程改造（例如，Akhlaghi等, 2025）。他们在Aspergillus flavus Uox（AFUox）中引入Q269L突变，使其在40℃下的半衰期从49.85分钟延长至85.55分钟。第三，通过共价结合、吸附或包封方法将Uox固定化（例如，Kilimci等, 2023）。他们将Candida属Uox固定化在磁性纳米线上，经过45℃下孵育180分钟后，固定化的Uox保留了65.09%的初始活性，而游离Uox仅保留了13.49%的活性。然而，Uox的修饰和固定化技术的实际应用仍面临诸多挑战，包括复杂的优化过程、大量的突变位点筛选以及某些固定化材料（如有毒交联剂或不可生物降解的载体）带来的环境问题。
本文提出了一种综合策略，通过将人铁蛋白与极端微生物Deinococcus radiodurans中的Uox融合，开发出新型重组Uox（DrUox-F）来应对这些挑战。铁蛋白由24个亚单位组成，可自组装成24聚体纳米笼结构（Tetter和Hilvert, 2017）。通过将单个Uox亚单位的编码基因与单个铁蛋白亚单位融合，表达的重组蛋白形成了24聚体纳米笼结构。这些纳米笼在宿主细胞中容易组装成微米级的超微颗粒，便于通过低速离心法纯化，纯度可与色谱标准媲美。令人鼓舞的是，DrUox-F的产率达到了890 mg/L，是目前文献中报道的最高产率。此外，可溶性DrUox-F在各种环境条件下的稳定性显著提高（特别是在碱性条件下：在pH 10下储存35天后仍保持100%的活性，在pH 11下储存11天后仍保持50%的活性）。更重要的是，通过添加甘露醇作为外源稳定剂，其半衰期延长了约40倍（从41小时延长至1880小时）。这种策略相比现有方法具有多重优势，包括简便高效的纯化过程、高产率和纯度，无需复杂的化学修饰和潜在的有毒试剂，同时实现了优异的热稳定性。重要的是，铁蛋白作为人体内的天然成分，进一步确保了其生物相容性。
材料
尿酸、氢氧化钾（KOH）、乙腈、Tris-HCl缓冲液和十二烷基硫酸钠（SDS）均购自Aladdin Biotech（中国上海）。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级。
蛋白质设计与基因构建
重组蛋白（命名为DrUox-F）是通过将DrUox（基因ID：DR_1160）的C端与人铁蛋白H链（GenBank ID：ON645351）通过连接子（EAAKEAAK）融合构建的。编码基因由苏州GENWIZ公司合成并测序。
重组DrUox-F的表达与纯化
我们之前的研究表明，铁蛋白可作为目标蛋白的有效纯化标签，通过离心法进行分离（Liu等, 2022b; Chen等, 2024）。利用这种方法，我们成功纯化了高纯度的DrUox-F。这种低速离心纯化方法比His标签亲和层析法更简单、成本更低。纯化的重组DrUox-F通过SDS-PAGE验证，显示出明显的条带。
结论
通过使用铁蛋白作为纯化标签，我们成功获得了24聚体DrUox-F，纯度达到98%，产率为890 mg/L，显著简化了纯化过程并降低了成本。与野生型DrUox（带有His标签）相比，DrUox-F在pH 10.0和25℃下孵育30天后仍保持100%的初始活性。
未引用参考文献
Jiang等, (2025)
CRediT作者贡献声明
余峰：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件应用、方法学、概念设计。
杨春：可视化、方法学。
葛慧华：方法学。
周登：方法学。
李洪春：可视化、资源获取、资金申请。
张光亚：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资源管理、项目协调。
张瑞芳：方法学。
陈亚欣：方法学。
周艳红：方法学。
吴志成：方法学。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了深圳市科技计划（JCYJ20220818100804009）和广东省珠江人才计划（2021QN020121）的支持。
