《Advanced Healthcare Materials》：High-Throughput Generation of Tumor Spheroids via Droplet Microfluidics for siRNA-Loaded Nanomedicine Assessment
编辑推荐：
本工作开发了一种流动聚焦液滴微流控平台，用于高通量生成均一的肿瘤球体，以评估基于siRNA（小干扰RNA）的纳米药物的疗效。该平台在5分钟内可产生超过50,000个液滴作为独立生物反应器，实现了大规模、均匀且功能相关的肿瘤球体的制备。通过对siRNA负载纳米颗粒的蛋白水平分析，验证了该平台在三维肿瘤模型中进行高通量、定量化功能评估的能力，为新型癌症纳米药物的临床前评估提供了一种强大且可扩展的方法。
引言
三维细胞培养模型中最广泛使用的肿瘤球体，已成为评估药物反应的可行平台。然而，利用肿瘤球体进行新型药物的高通量验证，仍然受限于大规模、均匀且功能相关球体的生成挑战。多种传统技术，如悬滴法、液体覆盖培养和旋转壁容器系统，由于通量低、操作繁复及尺寸变异大，往往难以满足高通量药物筛选的需求。微流控技术，特别是液滴微流控，通过精确控制流体流动和局部微环境，为解决这些限制提供了有前景的方案，其将多个细胞封装在离散的微滴中，实现了高均一性球体的生成。尽管液滴微流控在产生大量球体方面已展现出效率和适应性，但其在评估纳米药物疗效方面的应用仍相对有限且未被充分探索。本研究旨在开发一种用于生成肿瘤球体的液滴微流控平台，以实现纳米药物的高通量评估。
结果
2.1 肿瘤球体生成
研究采用流动聚焦液滴微流控装置，将肿瘤细胞封装在均匀的水包油微滴中，每个微滴作为一个独立的微环境，支持受控的细胞聚集和球体形成。MCF-7（人乳腺癌细胞）和U87 MG（人胶质母细胞瘤细胞）细胞在微滴内的聚集和球体形成过程，分别在孵育0小时、3小时和21小时后进行观察。在初始时间点（0小时），观察到单个细胞聚集在液滴中心附近。孵育3小时后，两种细胞系均显示出明显的聚集。到21小时，两种细胞类型均观察到球体形成，但形态存在差异：MCF-7球体呈现紧凑、球形结构，边界清晰光滑；而U87 MG球体则显得不那么紧密，轮廓不规则且细胞结合松散。这些形态差异归因于细胞固有的特性。
球体大小与每个液滴内封装的细胞数量密切相关，可通过调整初始细胞密度来调节。在固定的水油相比（9:15 μL/min）下，细胞浓度从10 million cells/mL增加到50 million cells/mL，每个液滴内封装的细胞数量从5 ± 3.23增加到44 ± 7.33。结果与理论估算值基本一致，证明了系统的整体可控性和可重复性。除了调节细胞浓度，水油相比也能影响液滴大小，从而调节细胞封装效率。在固定油相流速为15 μL/min下，随着水相流速从1 μL/min增加到13 μL/min，液滴直径从约61 ± 2.29 μm增加到142 ± 2.21 μm。该系统在特定流速比（9:15 μL/min）下，每5分钟可产生超过50,000个液滴，证明了其高通量能力。此外，平台生成的球体在单个批次内尺寸分布狭窄，表明平台具备一致的尺寸控制能力。
2.2 肿瘤球体表征
尽管平台可以提供快速且受控的球体形成，但封闭的液滴环境限制了肿瘤球体的长期培养。因此，将球体从液滴中释放到合适的外部环境中，以便进行进一步培养或分析。释放后，通过Calcein-AM和EthD-1染色评估细胞活力。结果显示，MCF-7和U87 MG肿瘤球体均表现出高活力，平均分别约为94.29%和98.78%。此外，免疫荧光染色证实了球体的细胞身份和肿瘤特异性特征：U87 MG球体表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），而MCF-7球体则显示雌激素受体α（ERα）阳性染色。
2.3 释放后肿瘤球体的生长
对从微滴中释放的肿瘤球体的生长特性进行了系统评估。在液体培养基中培养时，两种球体的平均直径从第1天的约50 μm增长到第7天的超过200 μm。值得注意的是，悬浮培养中的球体密度必须仔细调节，以避免意外的融合，这可能会损害单个球体的均一性和结构完整性。为了评估球体的侵袭潜能，将两种细胞类型的球体包埋在三维I型胶原基质中。结果显示，U87 MG球体表现出显著的侵袭行为，细胞在包埋后4小时即可观察到向周围胶原浸润。相比之下，MCF-7球体未表现出显著的侵袭活性，其整体尺寸增长与液体培养条件相似。
2.4 纳米颗粒向肿瘤球体渗透的评估
为了进一步评估微滴生成肿瘤球体在纳米药物评估中的适用性，本研究以小干扰RNA（siRNA）基纳米颗粒作为概念验证。利用氟化低分子量聚乙烯亚胺（PEI-F）作为siRNA载体，并用透明质酸（HA）进行包被以靶向CD44受体（该受体在多种肿瘤细胞中过表达）。装载siRNA后，PEI-F/siRNA复合物的平均流体动力学直径为40.3 ± 8.6 nm。HA包被后，纳米颗粒直径增加至约117.6 ± 1.3 nm，表面带负电（-30 mV），表明表面修饰成功。使用Cy5标记的siRNA负载纳米颗粒（PEI-F/siRNA-Cy5/HA）处理肿瘤球体，通过共聚焦显微镜获取Z轴堆叠图像。结果显示，纳米颗粒处理组在外层观察到强烈的荧光信号，并能清晰渗透到更深的区域。相比之下，游离siRNA-Cy5（对照组）处理未检测到荧光信号，表明游离siRNA无法渗透球体结构。对MCF-7和U87 MG球体内Cy5荧光强度的定量分析进一步证明，纳米颗粒显著增强了siRNA向三维肿瘤球体内部的递送效率。此外，U87 MG球体中的递送效率高于MCF-7球体。
2.5 利用肿瘤球体评估纳米药物疗法
作为功能验证，使用靶向信号转导和转录激活因子3（STAT3）的siRNA负载纳米颗粒评估其治疗效果。监测纳米药物治疗下球体在四天内的生长情况。结果显示，靶向STAT3的siRNA负载纳米颗粒（siSTAT3-NP）在U87 MG模型中比在MCF-7模型中表现出更显著的抑制效果。第4天进行的活/死细胞检测显示，与对照组（游离siSTAT3处理）相比，siSTAT3-NP处理组中死细胞比例显著更高。
在MCF-7球体中，尽管纳米颗粒渗透从球体表面开始，但细胞死亡并不局限于外围区域。在U87 MG球体中，siSTAT3-NP处理后，外周观察到更明显的细胞死亡。U87 MG细胞中相对较高的CD44介导的纳米颗粒摄取可能进一步促进了该模型中观察到的外周细胞活力丧失。
通过蛋白质印迹分析STAT3蛋白表达水平，结果显示siSTAT3-NP处理后STAT3蛋白表达降低。定量分析证实，与游离siRNA对照组相比，两种细胞系的siSTAT3-NP处理球体中STAT3表达均显著降低，其中U87 MG球体的降低幅度更大。这与图4中观察到的纳米颗粒在U87 MG球体中更有效的渗透相关。进一步探索剂量反应行为，发现用浓度递增的siSTAT3-NP处理肿瘤球体时，两种模型中均观察到清晰的浓度依赖性细胞活力降低。
讨论
据我们所知，这项研究首次证明了利用液滴微流体生成的球体对基于siRNA的纳米疗法进行高通量评估。通过利用该平台生产大量均一球体的能力，通过蛋白质表达的定量分析快速验证了siRNA负载纳米颗粒的治疗效果。该平台的均一性、可重复性和可扩展性增强了高通量药物筛选的可靠性，突显了其在临床前评估新型疗法方面的潜力。
与其他球体生成方法（如低附着板、悬滴法和微孔板）相比，液滴微流控平台具有独特优势。其关键优势在于极高的通量，球体产量可达每小时数万个。此外，该平台对初始细胞封装和局部微环境具有精确控制能力，提供了更大的实验灵活性，有助于产生高度均一的球体，并提高了纳米颗粒渗透和基因沉默测量的可重复性。
研究观察到siRNA纳米颗粒在MCF-7和U87 MG球体之间的渗透存在差异，这与这两种细胞类型形成的球体的固有结构特征一致。MCF-7细胞表现出上皮样特性，通常形成高度紧凑、细胞间粘附强的球体；而U87 MG胶质母细胞瘤细胞则形成松散且不那么紧凑的球体。这种结构差异影响了运输特性，更松散的结构对纳米尺寸试剂的渗透更具允许性。此外，CD44（一种参与纳米颗粒结合和细胞摄取的受体）表达的差异也可能导致了观察到的渗透效率差异。U87 MG细胞被报道表达相对较高水平的CD44，而MCF-7细胞中CD44的表达则更具可变性。
尽管取得了有希望的结果，但仍存在一些挑战。首先，液滴内生成的球体尺寸受限于密闭空间和营养供应受限。虽然将肿瘤球体从液滴中释放出来允许其进一步生长和下游应用，但这牺牲了为每个肿瘤球体维持独立微环境的优势。此外，入口处细胞随时间沉降会影响细胞封装的一致性，特别是在长时间的液滴生成过程中。释放后，高球体密度增加了不期望的融合事件的可能性。这些限制凸显了需要改进的工程解决方案，包括增强的液滴融合控制、改善的细胞悬浮稳定性以及保持球体独立性的释放后处理策略。
结论
本研究开发了一种用于高通量生成均匀肿瘤球体的液滴微流控系统，并证明了其在评估基于纳米颗粒的疗法方面的实用性。该系统提供了对球体形成的精确控制，能够以最小的尺寸变异实现可扩展且可重复的生产。从液滴中释放的球体保持了高活力，并在液体悬浮和三维基质环境中表现出持续生长。此外，通过定量蛋白质表达分析和活力测定，有效验证了siRNA负载纳米颗粒对肿瘤球体的治疗效果。这些结果证实了该平台能够在受控的高通量格式中促进纳米药物性能的评估。总体而言，这项工作为三维肿瘤模型中的纳米颗粒筛选建立了稳健的方法，为临床前药物评估提供了一种更准确、可扩展的途径。
方法
研究方法包括微流控器件制造、细胞培养、肿瘤细胞在液滴中的封装、肿瘤球体从液滴中的释放、活/死细胞活力测定、球体的免疫荧光染色、三维凝胶中的球体侵袭实验、siRNA负载纳米颗粒的制备、siRNA负载纳米药物在二维细胞培养和三维肿瘤球体中的评估，以及统计分析。详细步骤和参数已在原文方法部分阐述。
