《Advanced Healthcare Materials》：Biomimetic Copper Nanoparticles Coated with ACE2-Overexpressing Membranes for Selective SARS-CoV-2 Neutralization and Disinfection
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这篇研究报道了一种创新的仿生纳米平台，通过脂质体融合诱导膜交换（LIME）技术从过表达ACE2的哺乳动物细胞规模化制备膜整合脂质体（MILs），并将其包覆在铜纳米颗粒（Cu NPs）表面，形成Cu@MIL纳米结构。该平台兼具ACE2介导的病毒选择性捕获/中和能力与铜纳米颗粒的强效抗病毒活性，为COVID-19及其他受体特异性病原体提供了一种“诱饵+消毒”的双功能治疗策略。
ACE2过表达工程化哺乳动物细胞的构建
研究选用HeLa细胞作为模型，通过基因工程手段构建了过表达血管紧张素转换酶2（ACE2）受体的HeLa细胞系（ACE2-HeLa）。免疫荧光染色结果显示，亲本HeLa细胞的ACE2表达水平很低，而工程化HeLa细胞系则呈现出强烈的荧光信号，证实了ACE2受体的成功过表达。
细胞来源囊泡的规模化生产：LIME技术
为解决生物源性细胞外囊泡（EVs）产量低的问题，研究采用了一种称为脂质体融合诱导膜交换（LIME）的新策略。该方法将高流动性脂质体（由80% DOPC和20% DOPE组成）与细胞共孵育，显著促进了囊泡的分泌。通过超速离心获得的产物被称为膜整合脂质体（MILs）。透射电子显微镜（TEM）图像显示，HeLa MILs和ACE2-HeLa MILs均具有清晰的囊泡结构。动态光散射（DLS）分析表明，ACE2阴性和阳性MILs的水合直径分别为129.1 ± 7.1 nm和127.4 ± 7.8 nm。蛋白质定量显示，MILs的蛋白浓度（HeLa MILs: 1.1 mg/mL；ACE2-HeLa MILs: 1.3 mg/mL）显著高于生物源性EVs。纳米颗粒追踪分析（NTA）进一步证实，在相同细胞数量和孵育时间下，MILs的颗粒浓度比生物源性EVs高出10倍以上。细胞活力实验（MTT法）表明，LIME生产过程对细胞无毒害作用。
ACE2表达膜整合脂质体的仿生活性验证
为了确认ACE2在工程化HeLa细胞来源MILs表面的呈现，研究采用了免疫金TEM技术。结果证实，金纳米颗粒成功结合到ACE2-HeLa MILs上，表明其表面存在ACE2受体，这对于其作为靶向SARS-CoV-2的仿生诱饵纳米载体至关重要。Western Blotting也进一步确认了ACE2蛋白在ACE2-HeLa细胞裂解物、生物源性EVs和MILs中的存在。
抗病毒铜纳米颗粒的制备与表征
研究通过热分解法合成了表面包覆有TOPO和ODA的疏水性铜纳米颗粒（Cu@TOPO/ODA NPs），并利用配体交换反应，用亲水性的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）替代了疏水性表面活性剂，得到了水相分散的Cu@PVP NPs。TEM显示，Cu@TOPO/ODA NPs和Cu@PVP NPs均呈均匀球形，尺寸分布窄（约96.9 ± 11.7 nm）。紫外-可见光谱在585 nm处显示出特征吸收峰。DLS测得Cu@TOPO/ODA和Cu@PVP NPs的水合直径分别为110.0 ± 3.6 nm和122.3 ± 5.4 nm。傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、高分辨TEM和X射线光电子能谱等一系列表征均证实了铜纳米颗粒的成功合成与表面修饰。
抗病毒铜纳米颗粒的膜包覆
通过循环超声-冷冻法，将ACE2-HeLa MILs包覆到Cu@PVP NPs表面，制备了仿生Cu@MIL NPs。TEM成像显示，ACE2-HeLa Cu@MIL NPs呈均匀球形，尺寸分布为110.7 ± 8.5 nm。DLS显示包膜后平均水合直径从122.3 ± 5.4 nm增加至140.6 ± 14.6 nm。Zeta电位测量表明，包覆后表面电荷向负值偏移（-16.3 mV），与MILs本身的电位接近，提示了完整的膜包覆。SDS-PAGE和FTIR光谱分析证实了MILs中的生物活性蛋白（如波形蛋白、前角蛋白）和磷脂成分成功整合到了Cu@MIL NPs上。该纳米颗粒在PBS中表现出良好的胶体稳定性。
选择性SARS-CoV-2中和与消毒
生物安全性评估显示，Cu@PVP和Cu@MIL NPs在浓度高达20 ppm（以铜计）时，对正常细胞系（MRC-5和3T3）无明显细胞毒性。采用表达刺突蛋白（Omicron变体BA.2）和绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒基SARS-CoV-2假病毒系统评估了治疗潜力。假病毒能剂量依赖性地选择性感染过表达ACE2的HeLa细胞，而对低表达ACE2的亲本HeLa细胞则难以感染。ACE2-HeLa Cu@MIL NPs能以剂量依赖的方式有效阻断假病毒感染，其半数抑制浓度（IC50）为2.09 ppm，在3.75 ppm浓度下可抑制约90%的感染。相比之下，单独的ACE2-HeLa MILs在较高浓度（5 μg/mL，相当于10 ppm Cu@MIL NPs的膜蛋白量）下仅表现出部分中和能力（约40%抑制率），在较低浓度下则无显著抑制。
该Cu@MIL系统的核心优势在于其仿生和双模式抗病毒设计。ACE2呈递的MILs提供了多价受体阵列，通过协同作用增强与病毒刺突蛋白的结合，更接近模拟天然宿主细胞膜。同时，铜纳米颗粒核心通过铜介导的毒性提供了额外的、不依赖于受体的抗病毒机制。铜纳米颗粒可通过溶解依赖和非依赖的途径灭活病毒，包括直接与病毒组分相互作用、释放的Cu+/Cu2+导致衣壳损伤和蛋白质变性、以及催化产生活性氧（如超氧阴离子和羟基自由基）导致病毒基因组降解。
结论与展望
本研究首次成功将LIME技术应用于哺乳动物细胞系统，规模化生产了来自ACE2表达HeLa细胞系的囊泡（MILs）。同时，成功制备并修饰了具有抗病毒特性的球形铜纳米颗粒。通过将ACE2-HeLa MILs包覆在Cu@PVP NPs上，制备了仿生Cu@MIL NPs。这些呈现ACE2的Cu@MIL NPs兼具MILs优异的病毒靶向能力和铜的强大抗病毒特性，能够中和并灭活SARS-CoV-2病毒，为COVID-19治疗提供了一种有效策略。
除了概念验证的抗病毒模型，该策略还具有更广泛的应用前景：1）可将MIL包覆的纳米材料集成到抗病毒表面涂层中；2）源自受体工程化细胞的MILs可作为快速病毒预筛和生物传感平台的功能识别元件；3）LIME技术的可扩展性使得MIL功能化纳米材料能够整合到下一代个人防护装备（如口罩或过滤层）中。从转化角度看，基于当前实验室规模的估算，Cu@MIL的生产成本约为8.5美元/毫克，规模化生产后将显著降低，低于已报道的单克隆抗体成本，与蛋白质功能化纳米系统成本相当，这为其在抗病毒涂层、过滤材料等大批量应用中的可行性提供了支持。
