《Advanced Healthcare Materials》：Diels-Alder Click Chemistry as a Dynamic-Covalent Crosslinking Method in Spheroid-Encapsulating Hydrogels for Cartilage Engineering
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本研究报道了利用Diels-Alder（DA）点击化学作为动态共价交联策略，构建了由透明质酸（HA）、明胶和PEG组成的复合水凝胶，旨在优化软骨组织工程中的球体包裹与融合。通过调控交联pH（尤其在pH 6.8条件下），显著提升了水凝胶的刚度、稳定性及降解时间，使其更接近天然软骨细胞周基质（PCM）的力学性能。包裹的关节软骨祖细胞（ACPC）球体在28天培养期内保持高活力，并成功沉积富含II型胶原和硫酸化糖胺聚糖（GAG）的软骨样细胞外基质（ECM）。研究进一步发现，减小球体间距（100–150 μm）可促进球体融合并增强软骨生成；而通过熔融电写（MEW）支架增强后，复合材料的压缩模量提升了100倍以上。该工作为开发具有临床应用潜力的软骨植入物提供了新的材料平台。
引言：软骨修复的挑战与水凝胶策略
关节软骨是一种缺乏血管和淋巴的结缔组织，自我修复能力有限，其退行性疾病导致慢性疼痛。在软骨组织工程中，水凝胶作为临时三维支架，为软骨源性细胞提供支持性微环境，促进细胞外基质（ECM）沉积，并最终替代降解的聚合物网络。理想的水凝胶应具备生物可降解性、无细胞毒性及适宜的力学性能（压缩模量介于27–205 kPa），以模拟健康人体细胞周基质的刚度。本研究聚焦于利用Diels-Alder（DA）点击化学这一动态共价交联方法，构建基于透明质酸（HA）、明胶和聚乙二醇（PEG）的复合水凝胶，旨在克服传统DA水凝胶在软骨工程中面临的凝胶时间过长、降解过快及机械强度不足等挑战。
聚合物修饰与水凝胶设计
研究选用分子量为381–391 kDa的透明质酸（HA）以避免低分子量HA的免疫原性，并通过已优化的方法将其修饰为呋喃修饰的HA（HAFU），功能化程度（DF）达65%。明胶则通过呋喃缩水甘油醚与赖氨酸残基反应，引入呋喃基团（GelFU），功能化率达91.3%。使用商品化的四臂PEG-马来酰亚胺（4APM）作为交联剂。水凝胶由HAFU、GelFU和4APM按4:1的质量比组成，总聚合物含量（TPC）从3.5%增至6.5%，并保持呋喃与马来酰亚胺的摩尔比为5:1，以优化交联动力学。DA反应是一种可逆的[4+2]环加成反应，其动态性允许交联键的重排，但马来酰亚胺也可能水解为无活性的马来酰胺酸，导致水凝胶逐渐降解。
材料性能的优化
流变学测试表明，提高TPC可缩短凝胶时间并增加最终储能模量（G′）。有趣的是，在PBS中交联的水凝胶比在细胞培养基中交联的对应配方表现出更快的凝胶速度和更高的刚度，尤其在低TPC时差异显著。这归因于培养基中可能存在的碱性环境（如老化DMEM的pH可升至8.0）会加速马来酰亚胺水解，消耗有效交联基团。通过使用HEPES/PIPES缓冲液将交联pH精确控制在6.8（接近天然软骨基质pH 6.6–6.9），水凝胶的机械性能得到显著改善：与pH 7.4条件相比，最大G′提升78%，凝胶时间略有缩短，杨氏模量增加50%，完全降解时间延长了10天。6.5% TPC且在pH 6.8交联的水凝胶，其初始杨氏模量（21.8 ± 5.3 kPa）落在天然软骨细胞周基质刚度范围（20-200 kPa）的下限，且降解时间（4-5周）符合组织工程所需的1-2个月时间窗。
ACPC球体的形成与活力
研究使用高通量微孔板系统制备了约含1000个细胞的马关节软骨祖细胞（ACPC）球体。球体在3天的软骨分化培养中直径增长至约150 μm，圆形度显著改善，表明细胞间相互作用增强。长达14天的活/死染色显示球体保持高活力，未见坏死核心形成。
水凝胶的细胞相容性与ACPC球体的基质沉积
将ACPC球体包裹在pH 7.4或6.8交联的DA水凝胶中培养14天。活/死染色显示两种pH条件下球体均保持高活力。虽然乳酸脱氢酶（LDH）释放 assay 显示在pH 6.8封装初期（第1天）LDH释放量显著高于pH 7.4，但这仅相当于球体裂解释放量的不到三分之一，且后续时间点两者LDH水平相当，表明封装过程引起可逆的细胞应激，但水凝胶本身无细胞毒性。代谢活性、球体直径和DNA含量在14天内均随时间显著增加，表明细胞在球体内增殖。值得注意的是，由于pH 7.4交联的水凝胶稳定性不足，培养21天后其代谢活性和DNA含量常无法测量，凸显了在pH 6.8交联对于长达4周培养的重要性。
进一步研究聚焦于在pH 6.8交联的6.5% TPC DA水凝胶。生化分析和组织学评估表明，包裹的ACPC球体成功进行软骨分化并主动沉积ECM。培养14天内，GAG含量显著增加。第28天的组织切片显示，球体周围及球体内部均有蛋白聚糖（番红O染色阳性）和总胶原（天狼星红染色阳性）沉积。免疫染色揭示了II型胶原（软骨关键成分）在整个构建体中分布，在球体周围染色更强；而I型胶原（纤维软骨标志）在细胞呈现迁移行为而非球体融合的区域更明显。X型胶原（肥厚分化标志）表达水平很低，这与ACPCs保持非肥厚表型的报道一致。
球体间距对球体融合与II型胶原产生的影响
球体间距是影响融合和ECM沉积的关键因素。计算表明，初始低密度封装（>500 μm球体边缘间距）主要诱导细胞迁移行为，伴随I型胶原沉积。而将球体浓度提高10倍以上，使平均间距降至100–150 μm，则显著促进了球体融合。
通过Hoechst/Phalloidin染色观察细胞形态发现，间距>500 μm时，球体多呈现核心致密、边缘细胞向外延伸的“出芽”形态；而间距在100–150 μm时，球体融合事件明显增多。力学测试显示，高密度球体封装的水凝胶在培养初期刚度有所下降，可能因球体占据体积影响交联或细胞产生的酶导致早期降解。然而，与无球体或低密度球体的水凝胶随培养时间持续软化不同，高密度球体水凝胶的杨氏模量在7-14天后趋于稳定，并在第28天回升至2.5 kPa以上。生化分析证实，高密度球体构建体在第28天的GAG/干重比低密度构建体高出约4倍。组织学评估进一步显示，高密度条件下II型胶原沉积显著增加，II型与I型胶原的阳性面积比也大幅提高。
利用熔融电写支架增强水凝胶
尽管优化后的DA水凝胶初始刚度接近软骨细胞周基质，但仍远低于天然软骨ECM的整体刚度（0.1–1.6 MPa）。为此，研究引入熔融电写（MEW）聚己内酯（PCL）支架进行增强。将球体负载的DA水凝胶浇铸入MEW支架中成功构建了复合物。
力学测试表明，MEW支架本身（多孔结构）的刚度低于水凝胶，但其增强机制主要在于限制水凝胶在压缩过程中的水分排出（增加静水压）以及防止纤维屈曲。在封装当天，MEW支架使无球体构建体的压缩模量提升了8倍；而当结合高密度球体时，总刚度提升了12倍，表明球体本身也贡献了负载能力。培养28天后，无球体的MEW增强水凝胶持续软化，而球体负载的MEW增强构建体则在初始下降后（第1天至第14天）刚度趋于稳定，并在第28天保持在约400 kPa。同时，GAG沉积在14至28天间大幅增加，表明球体产生的ECM正在替代降解的水凝胶基质，有助于维持结构刚度。
共聚焦显微镜观察显示，第1天球体在MEW网格内清晰分离；第14天开始沿MEW纤维融合与迁移；第28天则形成基本融合的构建体。组织学分析证实，MEW支架的加入并未阻碍软骨分化，构建体在第28天沉积了富含GAG和II型胶原的ECM。然而，构建体在组织上仍呈现异质性，存在少量I型胶原区域，完全透明的软骨组织排列尚未实现。
结论
本研究证明，通过动态共价Diels-Alder点击化学交联的水凝胶可用于软骨组织工程。通过将交联pH调节至6.8，成功解决了传统DA水凝胶机械完整性不足、凝胶时间慢和降解快的问题，获得了刚度与天然软骨细胞周基质相当、稳定性足以支持包裹ACPC球体培养至少28天的水凝胶。球体在该水凝胶中保持活力并沉积富含II型胶原的软骨样ECM。减小球体间距至100–150 μm能有效促进球体融合和基质沉积。此外，利用MEW PCL支架进行增强，使复合物在第1天的压缩模量提升了12倍，到第28天更是比未增强构建体提高了100倍以上，显著提升了其作为软骨组织植入物的应用潜力。这项工作为开发具有临床前景的软骨植入物系统提供了新的见解和材料平台。
