锆铁氧体与氨基功能化MOF复合纳米颗粒固载Humicola insolens脂肪酶：沉淀-交联法与共价结合法的对比研究

《Nanoscale Advances》：Synthesis and characterization of ZrFe2O4 and ZrFe2O4@UiO-66-NH2 nanoparticles for efficient immobilization of Humicola insolens lipase: a comparative study of precipitation-crosslinking versus covalent binding methods

本研究系统对比了沉淀-交联与共价结合两种策略，将Humicola insolens脂肪酶固定于磁性锆铁氧体(ZrFe2O4)及其复合金属有机框架(ZrFe2O4@UiO-66-NH2)纳米颗粒上。研究发现共价结合法显著提升了酶负载量、固定化效率、热稳定性及重复使用性，并揭示了缓冲液组成对MOF结构稳定性的关键影响，为设计高效工业生物催化剂提供了重要见解。

　　

1. 引言

1.1. 背景介绍

酶，特别是脂肪酶，因其特异性、高效性及在温和条件下工作的能力，在众多领域具有重要价值。然而，其实际应用常受限于稳定性差、难以重复使用、成本高昂以及产物可能被酶残留污染等问题。酶固定化技术，即将酶结合到不溶性载体材料上，是解决这些挑战的有效途径。它不仅能克服酶回收的难题，还便于下游加工和连续操作，且在多数情况下能改善酶的性质。

1.2. 固定化策略与挑战

酶固定化的技术多种多样，包括吸附、包埋、封装、共价结合和交联等。根据酶与载体相互作用的性质，这些方法可分为可逆与不可逆两大类。其中，共价结合和交联法是两种最常用的不可逆固定化技术。在交联法中，酶分子之间通过交联剂形成共价键，生成稳定的三维酶网络，无需载体材料。尽管此法能有效提高酶的稳定性、可重用性和在不同条件下的活性，但也存在局限性，例如若交联不当可能导致机械稳定性低和酶渗漏。此外，通过离心或过滤从反应混合物中分离交联酶聚集体用于后续使用时，可能导致进一步聚集，增大尺寸，从而引起内部传质限制，降低固定化酶的效率。为解决这些问题，磁交联酶聚集体等创新策略被提出。在共价固定化中，酶分子的氨基酸残基与载体表面引入的活性官能团之间形成稳定的共价键。当酶从载体渗漏的风险较高时，这种不可逆固定化是首选的附着方法。共价固定在载体上的酶的性能受多种因素影响，包括载体的形状、尺寸和材料组成等特性，以及用于将酶固定到载体的方法和偶联过程中的具体条件。因此，选择合适的固定化载体和技术对于创建有效的生物催化剂至关重要。

1.3. 金属有机框架作为载体材料

金属有机框架（MOFs）因其低密度、大比表面积、高稳定性和结构可调性，成为酶固定化中广泛应用的多孔结晶纳米材料。其中，锆基MOFs（Zr-MOFs）以其多样的结构设计和显著的化学、热及水稳定性而闻名，在暴露于相当大的机械应力时也能保持结构完整性。这种耐久性主要归功于其框架中强大的Zr-O配位键和坚固的次级结构单元。因此，这类MOFs在酶固定化领域引起了极大的兴趣。为了进一步增强这些框架的功能性，可以将磁性组分（如Fe₃O₄、CoFe₂O₄）掺入其结构中，形成纳米磁性MOFs。这通常通过将磁性纳米颗粒嵌入MOF基质中或在磁性核上生长MOFs来实现。这些纳米磁性MOFs便于使用外部磁场从反应混合物中轻松分离和回收固定化酶，从而增强了其在生物催化和其他生物医学领域的实际应用性。纳米磁性MOFs的结构化孔隙率和功能可调性也允许与酶进行定制化相互作用，从而提高酶的活性和稳定性。然而，当使用锆基MOFs作为酶固定化载体时，选择合适的缓冲溶液至关重要，因为缓冲液的一些成分可能与MOF的金属中心或有机连接体相互作用，导致金属离子浸出或框架结构降解。

本研究重点聚焦于使用两种不同方法——沉淀-交联法和共价结合法，将Humicola insolens脂肪酶固定到锆铁氧体（ZrFe₂O₄）磁性纳米颗粒及其复合物ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂上。研究考察了缓冲体系（特别是磷酸钾缓冲液和Tris-HCl缓冲液）对酶固定化过程中UiO-66-NH₂框架稳定性的影响。在对获得的生物催化剂进行全面表征后，阐明两种固定化技术对酶负载量、固定效率、热稳定性和可重复使用性的影响。

2. 材料与方法

研究使用的材料包括购自诺维信的Humicola insolens脂肪酶，以及ZrOCl₂·8H₂O、FeCl₂·4H₂O、2-氨基对苯二甲酸（ATA）、ZrCl₄等化学试剂。采用了包括傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDX）、X射线衍射（XRD）、Brunauer–Emmett–Teller（BET）比表面积分析、动态光散射（DLS）和热重分析（TGA）在内的多种技术对合成的载体和生物催化剂进行表征。

2.2. ZrFe₂O₄纳米颗粒的合成

采用化学共沉淀法合成了锆铁氧体磁性纳米颗粒。将ZrOCl₂·8H₂O和FeCl₂·4H₂O加入80°C的蒸馏水中，在氮气氛围下剧烈磁力搅拌，并通过加入氢氧化钠溶液（2 M）将反应混合物的pH调节至10-12，直至出现黑色沉淀。将所得沉淀冷却至室温，用外部磁铁分离，并用去离子水彻底洗涤，最后在70°C下干燥12小时。

2.2.1. ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的合成

将0.25 g合成的ZrFe₂O₄纳米颗粒在30 mL DMF中超声分散20分钟形成均匀分散体。随后，将1 mmol的ZrCl₄和1 mmol的2-氨基对苯二甲酸加入磁性纳米颗粒悬浮液中，并超声处理15分钟。将反应混合物倒入100 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜中，密封并在120°C下保持24小时。容器冷却至室温后，用磁铁收集所得固体产物，并用乙醇洗涤。

2.3. 用于共价结合酶固定化的纳米颗粒表面修饰

ZrFe₂O₄纳米颗粒表面首先通过硅烷化过程使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化。随后，将APTES修饰的纳米颗粒用戊二醛进一步功能化以引入醛基，从而能够实现共价酶结合。根据相同的方法，通过戊二醛中的醛基与UiO-66-NH₂中连接体的氨基之间的希夫碱反应，对ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒进行修饰。

2.4. 脂肪酶在固体载体上的共价固定化

将10 mg每种修饰的纳米载体悬浮在含有1 mL酶溶液（8.5 mg mL^-1，0.01 M缓冲液，pH 7.4）的Eppendorf管中，在室温下于400 rpm的恒温振荡器中孵育5小时。固定化完成后，用磁铁分离沉淀并用Tris-HCl缓冲液洗涤。

2.5. 通过沉淀-交联法在载体上进行酶固定化

根据先前报道的程序，通过沉淀-交联法将酶固定到氨基硅烷功能化的锆铁氧体和ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂载体上。将20 mg每种纳米载体分散在含有500 μL酶溶液（34 mg mL^-1，50 mM缓冲液，pH 7.4）的管中。将2.26 mL饱和硫酸铵溶液引入混合物中，随后在4°C下搅拌30分钟。将适量体积的戊二醛（25%）注入上述混合物中并振荡，以使酶分子与载体材料交联2小时。孵育时间后，通过将含有混合物的管置于磁分离器上去除上清液。随后，将所得产物重新悬浮在Tris-HCl缓冲液中以洗去任何残留的未反应酶。

3. 结果与讨论

3.1. ZrFe₂O₄和ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒的表征

通过FT-IR、XRD、SEM、EDX、DLS和BET等技术对合成的磁性载体进行了表征。ZrFe₂O₄的FT-IR谱图中，568 cm^-1和453 cm^-1处的峰可分别归属于Fe-O和Zr-O键。约3431和1627 cm^-1处观察到羟基的伸缩和弯曲振动模式，表明载体上存在吸附水分子。对于ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂载体，伯胺基团的对称振动模式出现在3383 cm^-1，而相应的不对称伸缩出现在3446 cm^-1。此外，在769和649 cm^-1观察到的特征峰归属于Zr-O键的伸缩振动。1652 cm^-1处的振动频率归属于N-H键的弯曲振动。与羧酸根的不对称和对称伸缩振动以及芳香胺的C-N伸缩振动相关的吸收带分别出现在1571、1436、1377和1247 cm^-1处，这与早期文献记录的结果一致。

X射线衍射分析用于进一步阐明这些材料的结构组成和晶体特性。ZrFe₂O₄的XRD图谱中，在2θ值为30.11°、35.38°、42.70°、52.54、56.74°和62.51°处观察到的衍射峰分别对应于（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面。这些峰与文献数据吻合良好，表明ZrFe₂O₄的成功合成。ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的XRD图谱清楚地显示了ZrFe₂O₄和UiO-66-NH₂的特征峰。在2θ值为7.26（111）和8.36（200）处出现的两个特征峰与UiO-66-NH₂的晶体结构一致，证实了UiO-66-NH₂在ZrFe₂O₄纳米颗粒上的成功合成和沉积。值得注意的是，与ZrFe₂O₄相关的衍射峰仍然很突出，表明在合成过程中ZrFe₂O₄的结构完整性得以保留。

通过SEM和EDX光谱进一步分析了合成载体的结构，以提供有关样品组成及其表面形貌的更多信息。ZrFe₂O₄纳米颗粒呈近乎均匀的球形，并有一定程度的团聚。团聚倾向在磁性纳米颗粒中很常见，这是由于它们具有很强的磁偶极-偶极作用和范德华力。此外，EDX光谱证实了ZrFe₂O₄组合物中存在铁（Fe）、锆（Zr）和氧（O）。在用UiO-66-NH₂包覆后，纳米颗粒保留了近乎球形的形状，但团聚程度似乎有所降低，颗粒表现出更规则和分散良好的外观。包覆后颗粒分散性和形态的改善可归因于MOF层的稳定作用，其通过提供增强胶体稳定性的保护壳来防止颗粒聚集。此外，在ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的EDX谱图中检测到碳和氮峰，证实了在晶体磁性核上成功合成了UIO-66-NH₂。

采用DLS技术测定了合成纳米颗粒胶体分散体的粒径分布。锆铁氧体纳米颗粒表现出两个不同的群体，平均直径分别为140.8 nm和741.4 nm，分别对应于较小颗粒和轻微聚集体。计算出的Z平均流体动力学直径为316.8 nm，多分散指数（PDI）为0.392，表明具有中等多分散性。对于ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米复合材料，Z平均流体动力学直径为310.3 nm，PDI为0.462。主要颗粒群体集中在211.3 nm左右，一小部分在1373.7 nm。与原始ZrFe₂O₄相比，流体动力学直径略小，这表明由于有效的表面功能化，胶体稳定性得到改善，聚集减少。DLS获得的粒径大于SEM观察到的粒径，这与文献一致。这种差异归因于布朗运动对DLS测量的影响。DLS测量的是包括核、表面层和溶剂化壳的流体动力学直径，而SEM仅反映固体核尺寸。因此，通过DLS测量的尺寸通常大于通过电子显微镜技术观察到的尺寸。

通过氮气吸附-脱附分析评估了合成材料的织构性质，并根据IUPAC方案对等温线进行了分类。原始ZrFe₂O₄纳米颗粒表现出II型等温线，氮气吸附量非常有限，BET比表面积仅为15.2 m²g^-1，孔体积为0.052 cm³g^-1，平均孔径为13.8 nm。该模式反映了裸露铁氧体表面基本上无孔或大孔的性质。在用UiO-66-NH₂修饰后，等温线转变为I型轮廓，其特征是在低相对压力下急剧吸附，这是微孔框架的典型特征。同样，比表面积急剧增加至65.5 m²g^-1，孔体积增加至0.176 cm³g^-1，而平均孔径减小至10.7 nm，证实了MOF壳引入了微孔性。

3.2. 制备的生物催化剂的表征

通过沉淀-交联和共价结合两种不同的方法将Humicola insolens脂肪酶固定在ZrFe₂O₄和ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒载体上。通过FT-IR光谱、XRD、TGA、SEM和EDX分析等一系列综合技术对所得生物催化剂进行了表征。为了创建酶的共价连接，首先用APTES修饰ZrFe₂O₄纳米颗粒的表面，然后用戊二醛处理。在APTES修饰的纳米颗粒光谱中，1052 cm^-1处观察到的峰可归属于Si-O键的伸缩振动。此外，在2923和2851 cm^-1处分别检测到与CH₂基团的不对称和对称伸缩振动相关的吸收带。在载体用戊二醛处理后，在1716 cm^-1处出现新的FT-IR吸收带，证明戊二醛已通过胺官能团有效地与载体结合。酶在ZrFe₂O₄纳米颗粒上的固定化通过1052 cm^-1处光谱带相对强度的增加以及其各自吸收最大值的显著移动得到证明。此外，在1453、1340和1651 cm^-1附近出现吸收带，表明酶与功能化载体之间发生了交联反应。

ZrFe₂O₄纳米颗粒的特征峰同样在生物催化剂的XRD图谱中被检测到，表明酶分子的掺入并未改变载体的晶体结构。此外，利用热重分析（TGA）观察了所制备生物催化剂的热分解过程。在100°C以下检测到的初始质量减少（约5%）与物理吸附水的蒸发以及样品的部分脱水有关。随后，在TGA曲线上观察到直至约275°C的质量逐渐下降，随后在300至450°C之间发生更急剧的质量损失。总体而言，在100-549°C温度范围内观察到的约23%的质量减少归因于固定在载体上的功能部分和酶分子的热降解。

如SEM图像所示，在脂肪酶固定化后，一些颗粒的边界表现出一定程度的模糊，这表明固定化过程中发生的化学反应部分改变了ZrFe₂O₄纳米颗粒的表面形态。通过EDX光谱中检测到生物催化剂对应的氮和硫光谱峰，进一步证实了酶在载体上的固定化。

图示了Humicola insolens脂肪酶、戊二醛功能化的ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒以及由此产生的生物催化剂对应的红外光谱。在1708 cm^-1处观察到的峰证明，作为酶附着交联剂的戊二醛已与载体的胺基有效反应。在酶固定化过程之后，在1051和1652 cm^-1处出现了新的特征带，表明脂肪酶分子通过交联反应共价结合到活化的ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒表面。

通过XRD、SEM和EDX光谱进一步阐明了所得生物催化剂的组成和结构特征。尽管生物催化剂XRD图谱中峰的位置保持一致，但观察到其强度有所变化，这可归因于酶与载体之间的相互作用。从SEM图像进一步观察到，在酶固定化后，载体表面的形态特征没有发生显著变化。最后，通过EDX光谱中检测到N和S峰，证实了酶与ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂纳米颗粒的结合。生物催化剂的TGA曲线表明，在低于100°C的温度下质量减少约5%，这归因于从载体上去除吸附的水分子。失重率一直降低到约250°C，然后在250至400°C的温度范围内急剧加速，这与有机组分和酶分子的分解有关。

3.3. 缓冲液对酶固定化的影响

缓冲液的组成会通过降解配位键显著影响MOFs的结构稳定性。因此，使用金属有机框架作为酶载体的一个关键考虑因素是它们在缓冲溶液中的稳定性。磷酸盐缓冲液由于其与活体组织和微生物良好的相容性，常用于生物和医学应用，特别是在酶固定化领域。在本研究中，酶固定化最初在50 mM磷酸钾缓冲液中进行。在此条件下制备的生物催化剂的FT-IR分析显示，特征性MOF峰缺失，并且在1022 cm^-1处存在显著的吸收，即使当载体仅暴露于不含酶的磷酸盐缓冲液时，该吸收也持续存在。这表明观察到的峰是由于吸附的磷酸根离子，而不是成功的酶固定化。这些观察结果与Ahmad等人的发现非常一致。为了进一步评估磷酸盐缓冲液对MOF结构的影响，对浸泡在磷酸盐缓冲液后的载体进行了XRD分析。XRD图谱显示ZrFe₂O₄@UiO-66-NH₂的特征峰显著丧失，主要衍射峰消失，结晶度显著降低。这些结果证实磷酸盐缓冲液会诱导MOF结构发生实质性降解。另一方面，在使用低浓度Tris-HCl缓冲液（≤10 mM）制备的生物催化剂的FT-IR光谱中，载体和酶的主要峰都清晰可辨。这表明低浓度的Tris-HCl缓冲液与UiO-66-NH₂结构高度相容。B??ek等人在研究UiO-66框架在常用缓冲溶液中的稳定性时获得了类似的结果。磷酸盐缓冲液会导致UiO-66结构降解，因此应避免在任何浓度下使用。相比之下，低浓度的TRIS缓冲液被推荐为UiO-66的合适介质。在磷酸盐缓冲溶液中，磷酸根离子作为配体，能够取代MOFs中的有机连接体。这些离子显著降低了金属有机框架的稳定性，特别是那些具有羧酸配体和高价金属离子结构的框架。因此，本研究由于低浓度Tris-HCl缓冲液与载体结构的相容性，选择其用于酶固定化。

3.4. 通过沉淀-交联法制备的生物催化剂的固定化产率和效率

Bradford蛋白测定法确定了附着在载体上的酶总量，而固定化脂肪酶的残留活性通过活性测定进行评估。沉淀-交联法在ZrFe₂O₄纳米颗粒上实现了260 mg g^-1的酶负载量，固定化效率约为40%。在Z