《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Mature T-cell leukemia/lymphoma with an NK-like immunophenotype: A report of 7 cases
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本研究综述了7例具有NK细胞样免疫表型（CD56/CD94/CD16阳性而表面CD3/CD5/TCR阴性）的成熟T细胞淋巴瘤/白血病。文章通过整合流式细胞术、免疫组织化学（如BCL11B、cCD3ε）及分子检测（TCR基因重排），系统阐述了如何在此类诊断困境中准确区分T细胞与NK细胞肿瘤，为病理诊断提供了关键的多模态鉴别思路与实践指导。
1. 引言
在大多数反应性或肿瘤性情况下，T细胞和自然杀伤（NK）细胞可以通过其独特的免疫表型特征进行区分。典型的T细胞表达表面CD3（sCD3），而NK细胞则为阴性；相反，CD16、CD56和CD94等分子的表达则支持NK细胞谱系。然而，在某些情况下，T细胞和NK细胞可能表现出重叠的免疫表型。例如，NK细胞谱系标志物CD56也在一部分γδ T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞上表达。同样，杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）和CD94/NKG2A等NK细胞标志物也可在某些CD8+T细胞亚群中检测到。甚至通常被认为是NK细胞特异性的自然细胞毒性受体（NCRs），包括NKp30、NKp44和NKp46，也能在某些T细胞亚群中表达。反之，一小部分正常NK细胞表达CD8，罕见的NK细胞表达CD5，这两种标志物通常与T细胞相关。
在恶性肿瘤背景下，异常的抗原表达模式可能导致更显著的免疫表型重叠，在某些肿瘤病例中，区分T细胞和NK细胞变得极具挑战性。一些成熟T细胞肿瘤的特征是丢失了传统的T细胞标志物（如sCD3和CD5），并异常获得了NK细胞相关标志物（如CD56和CD94的均一表达），导致其免疫谱与NK细胞肿瘤非常相似。这种表型改变可见于多种T细胞肿瘤，包括T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）、肝脾T细胞淋巴瘤（HSTCL）、肠病相关T细胞淋巴瘤（EATL）、单形性嗜上皮性肠道T细胞淋巴瘤（MEITL）和EBV阳性T细胞淋巴瘤（EBV+T-NHL）。
2. 患者与方法
本研究回顾性分析了自2017年以来诊断的成熟T细胞淋巴瘤/白血病病例，将那些通过流式细胞术和免疫组织化学分析具有NK样免疫表型的病例纳入研究队列。所有病例均根据第5版WHO-HAEM和2022年国际共识分类（ICC）标准进行分类。
流式细胞术免疫表型分析使用新鲜骨髓（BM）穿刺液、外周血（PB）样本、体液和/或组织标本进行，采用标准染色/裂解/洗涤方案。使用的抗体组合包括CD2、表面CD3（sCD3）、细胞质CD3ε（cCD3ε）（克隆SK7-Leu4）、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD16、CD25、CD30、CD56、CD57、CD94、TCRαβ、TCRγδ、TRBC1、CD158a/h、CD158b、CD158e和NKG2A。分析使用FCS Express软件进行。
免疫组织化学研究使用4微米厚的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行。用于谱系确定的关键抗体包括BCL11B、CD3（克隆LN10）、CD4、CD5、CD56、TCR-βF1和TCR-δ。对BCL11B染色的判读依据先前描述的方法进行。
T细胞受体（TCR）基因重排分析从BM穿刺液、PB标本或FFPE组织切片中提取基因组DNA。使用基于聚合酶链反应（PCR）的方法评估T细胞受体β（TRB）和γ（TRG）基因的克隆性。
3. 结果
3.1 临床特征
研究共纳入7例患者，包括3男4女，诊断时中位年龄为65岁（范围38-79岁）。病例包括3例外周T细胞淋巴瘤，非特指型（PTCL， NOS）、2例T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）和2例肝脾T细胞淋巴瘤（HSTCL）。在1例PTCL， NOS（病例 #7）中，肿瘤细胞EBER阳性。所有T-LGLL和HSTCL病例的累及部位均为PB和BM。脾脏受累见于1例T-LGLL和全部2例HSTCL病例。所有3例PTCL， NOS均显示广泛的淋巴结和结外部位受累。
3.2 流式细胞术发现
所有7例病例的CD45均为强阳性。在全部7例病例中，肿瘤细胞均阴性表达sCD3、CD4、CD5、TCRαβ、TCRγδ和TRBC1。CD2在全部7例中阳性，CD7在3例中表达缺失。CD8在4例中部分阳性。关于NK细胞标志物，CD56在5例中均一阳性，在其余2例中部分阳性。CD94在全部7例中均一阳性。CD16在4例中阳性，均显示均一表达。这些免疫表型特征与NK细胞非常相似。
其他抗原如KIR抗原（CD158a/h， CD158b， CD158e）在4例中进行了评估，其中3例全部阴性，病例 #5则显示出动态变化。NKG2A仅在病例 #5中检测，初诊时80%的肿瘤细胞阳性。CD57在7例中的3例（病例 #2、3、6）部分阳性。
在病例 #5和 #6中，流式细胞术在不同时间点进行，得以评估抗原表达的动态变化。病例 #5中KIR抗原表达存在动态变化。病例 #6在复发时肿瘤细胞sCD3阴性，但在一年前的初诊时流式检测显示sCD3阳性，表明sCD3表达可从阳性转为阴性。
使用特异性识别T细胞的CD3抗体（克隆SK7），在3例病例（#1、5、7）中评估了cCD3表达，其中两例（#5和 #7）显示中度至强cCD3表达。
3.3 免疫组织化学和原位杂交发现
使用可同时识别T和NK细胞的CD3抗体（克隆LN10），所有7例病例CD3均为阳性。同样，所有评估病例的CD56（n=7）和BCL11B（n=6）均为阳性。对于BCL11B，以背景反应性T细胞为内部阳性对照，3例显示与背景T细胞相当的均一强表达，而其余3例显示异质性模式，部分细胞中度表达，其余肿瘤细胞强表达。细胞毒性标志物（TIA1、颗粒酶B、穿孔素）在6例中评估，所有病例至少表达一种细胞毒性标志物。TCRαβ和TCRγδ在6例中评估；病例 #3显示TCRαβ表达，其余病例TCRαβ和TCRγδ均为阴性。EBV原位杂交在6例中进行，病例 #7 EBER阳性。
3.4 TRB和TRG基因重排结果
分子研究评估TCR基因重排的结果显示，所有7例均检测到克隆性TRG基因重排。4例病例（#2、4、6、7）同时显示克隆性TRB基因重排。
3.5 流式细胞术、免疫组织化学和分子发现的整合
所有7例病例中肿瘤细胞的T细胞谱系均基于多条证据线确立。在3例（#2、#4和 #6）中，T细胞谱系得到克隆性TRG和TRB基因重排以及BCL11B表达的支持。病例 #6初诊时的sCD3表达也支持其T细胞谱系。在病例 #1、#3和 #5中，T细胞谱系得到克隆性TRG基因重排和BCL11B表达的支持。此外，病例 #3通过免疫组织化学分析显示TCRαβ阳性。对于病例 #7，T细胞谱系得到克隆性TRG和TRB基因重排的支持。病例 #5和 #7中，使用T细胞特异性抗体通过流式细胞术检测cCD3也为阳性，为这两例的T细胞谱系提供了进一步证据。
3.6 与NK细胞肿瘤的比较
为了比较这些NK样T细胞淋巴瘤/白血病与真正的NK细胞肿瘤的病理特征，研究者收集了17例NK细胞肿瘤病例进行比较。简要而言，在15例中进行了TRB和TRG重排分析，结果全部为阴性。在全部17例中通过免疫组织化学评估了BCL11B表达；12例（71%）为阴性，其余5例为阳性，其中4例（23%）染色弱，1例（6%）染色强度中等。在5例中通过流式细胞术评估了细胞质CD3（cCD3）表达；3例完全阴性，2例显示部分阳性。
4. 讨论
本研究展示了7例具有NK样免疫表型的成熟T细胞淋巴瘤/白血病，其特征是丢失T细胞标志物（sCD3、CD4、CD5和TCRs）并获得NK细胞标志物（CD16、CD56和CD94）。所有病例均为细胞毒性T细胞肿瘤，这通过免疫组织化学显示的细胞毒性标志物表达得到证实。它们的T细胞谱系得到了以下证据的支持：使用T细胞特异性CD3抗体检测到中度至强细胞质CD3表达、BCL11B表达、克隆性TCR基因重排，以及通过免疫组织化学检测到TCRαβ、TCRγδ或TRBC。
sCD3表达通常被视为T细胞谱系最特异的标志物之一。然而，在T细胞肿瘤中经常观察到sCD3的异常减少或丢失。使用特异性识别T细胞的CD3抗体评估细胞质CD3（cCD3），可以帮助在sCD3阴性的病例中区分T细胞和NK细胞。T细胞中的CD3由四条不同的链组成：γ、δ、ε（跨膜）和ζ（细胞质）。在T细胞中，ε链与γ和δ链形成异二聚体（εγ和εδ）。NK细胞仅表达细胞质游离的ε和ζ链。因此，特异性识别εγ和εδ异二聚体的CD3抗体可以帮助区分T细胞和NK细胞。使用这些抗体进行的cCD3染色在NK细胞中为阴性或仅限于一小部分NK细胞，而强且均一的表达则支持T细胞。
BCL11B是一种转录因子，在促进T细胞发育中起关键作用。在造血淋巴样细胞中，BCL11B的表达主要局限于T细胞。因此，通过免疫组织化学检测BCL11B已成为确认造血淋巴样肿瘤中T细胞谱系的有价值的诊断工具。需要注意的是，某些T细胞肿瘤亚型可能缺乏BCL11B表达。关于NK细胞是否表达BCL11B仍存在争议。本研究纳入的17例NK细胞肿瘤中，大多数BCL11B为阴性，在少数阳性病例中，大多显示弱染色强度。综合来看，通过免疫组织化学评估检测到的强BCL11B表达高度提示T细胞谱系，并非NK细胞肿瘤的特征。
T细胞表面TCRs的表达需要TCR与所有四条CD3链的协调组装。当表面CD3丢失时，这种组装无法发生，导致表面TCR和TRBC1/2的缺失。在这种情况下，表面TCR和TRBC1/2的缺失无法区分T细胞和NK细胞，因为两者对这些标志物均为阴性。然而，通过免疫组织化学分析评估细胞质TCR表达仍可提供有用的谱系信息。在本研究中，病例 #3通过免疫组织化学显示TCRαβ阳性，尽管通过流式细胞术未检测到表面TCR。在这种情况下，细胞质TCRs的表达支持其T细胞谱系。
通过分子分析进行TCR基因重排是区分T细胞和NK细胞肿瘤时确立T细胞谱系的一种敏感且通常特异的方法。然而，交叉谱系TCR基因重排确实存在。此外，在基于PCR的TRG检测中可能出现假阳性TRG重排。因此，在此背景下解释TCR重排结果时需要谨慎。在实践中，应结合其他关键的谱系定义标志物（特别是表面或细胞质CD3，以及TCRs、TRBCs和BCL11B的表达状态）来解释TCR基因重排结果。
总之，T细胞肿瘤可能表现出NK样免疫表型，这带来了诊断挑战。因此，采用多模态方法对于准确确定T细胞和NK细胞谱系至关重要。推荐的研究包括TCR重排的分子分析、使用T细胞特异性CD3抗体评估细胞质CD3表达，以及通过免疫化学检查BCL11B、细胞质TCRs和TRBCs的表达。通常，肿瘤性NK细胞缺乏TCR基因重排，并且在使用T细胞特异性CD3抗体检测时，对TCRs、TRBCs、BCL11B和细胞质CD3呈阴性。相反，肿瘤性T细胞通常显示TCR基因重排，并且通常对BCL11B和使用T细胞特异性抗体的细胞质CD3呈阳性。细胞质TCR和TRBCs的表达也支持T细胞谱系。
