一种经过验证的用于测定激肽酶活性的高效液相色谱（HPLC）方法及其在评估水果提取物中的应用

《Journal of Chromatography B》：A validated HPLC method for kallikrein activity assessment and its use in evaluating fruit extracts

高效液相色谱法准确测定激肽释放酶活性及其在复杂基质中的应用。通过分离底物BAEE与产物BA（保留时间15.5 vs 5.5 min），建立线性范围1-5 min、回收率100.9%的方法，检测限0.25 mg/L。分析18种水果提取物发现水提物抑制、乙醇提物促进，胃蛋白酶水解物效果显著分化，验证了HPLC方法在KLK活性检测中的可靠性。

　　

任汉英|谢琳|赵灿|凌巧佳|顾双|王向阳

浙江工商大学食品科学与生物技术学院，杭州310018，中国

摘要

传统的紫外-可见光（UV–vis）分光光度法用于检测激肽释放酶（KLK）活性，该方法通过监测N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在253 nm处的水解来测定活性，但由于光谱干扰，在复杂样品中容易出现较大误差。本研究旨在建立一种高效液相色谱（HPLC）方法以克服这一限制。该方法能够完全分离BAEE及其产物N-苯甲酰-L-精氨酸（BA），保留时间分别约为15.5分钟和5.5分钟。实验结果显示，在1–5分钟的反应时间内该方法具有优异的线性，并且精度高、重复性好、准确度高（平均回收率为100.9%）。BA的检测限（LOD）为0.25 mg/L。将该方法应用于18种水果的水提取物、乙醇提取物和胃蛋白酶水解提取物后，发现不同提取物对KLK活性具有不同的调节作用：乙醇提取物倾向于促进KLK活性，而水提取物主要具有抑制作用；值得注意的是，胃蛋白酶水解提取物的效果最为显著且多样，从强烈抑制（如猕猴桃）到显著激活（如芒果）均有体现。这些结果表明，所建立的HPLC方法是评估复杂样品中KLK活性的可靠工具，并成功识别出某些水果提取物作为新型KLK调节因子的来源。

引言

高血压是心血管疾病的主要风险因素之一，在全球范围内发病率很高[1]。肾素-血管紧张素系统（RAS）是调节体液的重要系统，通过血管紧张素I转化酶（ACE）来调节血压[2]。ACE将无活性的Ang I转化为活性Ang II，并降解活性缓激肽（BK），从而升高血压。与此同时，来自激肽释放酶-激肽系统（KKS）的激肽释放酶（KLK）可促进BK的生成，进而释放一氧化氮（NO）和前列腺素等血管扩张因子，从而降低血压[3]。因此，ACE和KLK活性的平衡对血压稳态至关重要。尽管已从食物中鉴定出许多ACE抑制肽[4]、[5]、[6]，但关于调节KLK活性的食物成分的研究仍较为匮乏，这凸显了相关知识的空白。

KLK是一种丝氨酸蛋白酶，存在于血浆和组织中[7]。血浆中的KLK与凝血因子XII（FXII）相互作用，使其裂解为FXIIα，FXIIα再激活血浆中的KLK前体形成活性KLK。血浆中的KLK和FXIIα均参与激肽原的裂解，释放缓激肽，从而调节体内血压[8]。组织中的KLK酶原主要存在于胰腺、肾脏和肠道中。激活后，KLK会分解激肽原，产生赖氨酸缓激肽，后者进入组织毛细血管后进一步被氨基肽酶裂解，生成更活性的缓激肽。这些释放缓激肽的酶属于KLK家族，该家族包含15种分泌蛋白[9]。从组织中提取的KLK被广泛用于临床治疗高血压[10]、[11]：它可以扩张毛细血管和动脉，增加其通透性，降低外周血管阻力，促进水分和钠的排泄，从而温和地降低血压。KLK还与血管活性物质相互作用，促进电解质转运和稳态调节，从而参与血压调节[12]。组织中的KLK家族成员在多种生理过程中发挥重要作用，包括皮肤疾病、前列腺健康、糖尿病和癌症[13]。因此，研究食物成分对KLK活性的影响有助于了解它们对高血压的影响。

现有文献中检测KLK活性的方法通常参考ChemBK推荐的方法[https://www.chembk.com]，该方法使用253 nm处的紫外分光光度计来测定KLK酶活性。底物N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）在KLK作用下生成N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）和乙醇。BAEE和BA都是相对稳定的化合物，其中BA在253 nm处的吸光度高于BAEE。通过测量两者吸光度的差异来计算KLK活性。为避免胰蛋白酶的干扰，会添加胰蛋白酶抑制剂；大豆胰蛋白酶抑制剂可以抑制胰蛋白酶活性，但不会抑制血浆中的KLK活性[14]、[15]。BAEE被用作检测KLK活性的底物[16]、[17]。其他方法包括使用羟胺和氯化铁进行比色反应来定量剩余的BAEE[18]、[19]、[20]，或通过NADH耦合测定法测量生成的乙醇[21]。虽然色谱技术（如HPLC）在分离底物和产物方面已被广泛应用，但专门针对KLK-BAEE系统的应用尚未得到系统开发和验证。

然而，在我们的初步实验中发现了UV–vis方法的一个显著局限性：BAEE和BA的吸收光谱有很大重叠，在典型实验条件下253 nm处的吸光度差异小于12%。在分析复杂样品（如粗果提取物）时，这种微小的差异信号容易被样品基质的背景干扰掩盖，导致KLK活性测定出现较大误差和准确性较差。因此，本研究旨在使用HPLC在同一波长下分离底物和产物峰，从而建立更准确的检测方法。为此，本研究旨在开发、优化并全面验证一种用于评估KLK活性的可靠HPLC方法，具体方法是基于BAEE向BA的转化过程。主要目标是：（1）实现BAEE和BA的清晰色谱分离，消除光谱干扰；（2）确定并验证该方法的精度、准确性和回收率；（3）通过可靠地评估各种水果提取物对KLK活性的调节作用（抑制或促进），证明其实际应用价值，这些作用是传统UV–vis方法无法实现的。

材料与试剂

猪胰腺在屠宰后4小时内迅速运送至实验室。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）和N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）以及标准KLK试剂购自麦克莱恩试剂有限公司（上海，中国）。大豆胰蛋白酶抑制剂购自阿拉丁试剂有限公司（上海，中国）。其他所有化学试剂均为分析级。

从猪胰腺中提取和纯化KLK

根据顾等人的方法[3]，将猪胰腺切成小块后...

通过紫外分光光度法测定KLK活性

使用紫外分光光度仪检测KLK催化的底物BAEE及其产物BA的吸光度。结果发现，如图1所示，BAEE和BA在253 nm处的吸收峰有重叠。然而，相同摩尔浓度下，BA在253 nm处的吸光度比BAEE高13.15%，如图2所示。这表明BAEE转化为BA后，A₂₅₃吸光度增加。

KLK标准品和猪胰腺提取物KLK样品的结果

目前已知有超过15种KLK类型，标准KLK制剂可代表...

结论

在本研究中，我们开发并验证了一种新的HPLC方法，通过直接定量酶反应早期阶段（5分钟）生成的BA来准确测定KLK活性。该方法克服了传统UV–vis方法的重大局限性，特别是其在复杂样品中容易受到光谱重叠和基质干扰的影响。所开发的方法在科学稳健性、线性和灵敏度方面表现出色。

CRediT作者贡献声明

任汉英：撰写初稿、验证、软件开发、数据分析。谢琳：撰写初稿、数据可视化、验证、软件应用。赵灿：数据可视化、方法验证、数据分析。凌巧佳：数据可视化、方法学研究、数据管理。顾双：撰写与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计、软件应用。王向阳：撰写与编辑、初稿撰写、项目监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢浙江工商大学数字建设项目管理（SZJ2022c008）和浙江省高校基本科研经费（FR24003Q）的财政支持。