《Journal of Chromatography B》：Pharmacokinetic, tissue distribution, permeability, protein binding and stability studies of finerenone in SD rats using validated UPLC and LC-MS method
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新型非甾体MR拮抗剂Finerenone在SD大鼠中的药代动力学及组织分布研究，通过LC-MS/MS方法完成生物分析方法验证，评估了药物在不同体液中的溶解性、稳定性及生物利用度，发现其口服生物利用度为49.17%，组织分布以肠道最高，心脑肝等次之，支持临床应用。
作者：Shivam Rathaur、Parag Varshney、Debalina Maity、Jiaur R. Gayen
印度北方邦勒克瑙，CSIR-中央药物研究所药物学与药代动力学部门，邮编226031
摘要
Finerenone（FNR）是一种新型的选择性非甾体盐皮质激素受体拮抗剂，用于治疗与糖尿病相关的慢性肾病。本研究旨在开发一种新型的、可重复的、高灵敏度的生物分析方法，该方法基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）。该方法首次在大鼠血浆中得到了验证，并用于测定FNR的药代动力学（PK）和组织分布（TD）。我们对FNR进行了体内药代动力学、体外溶解度研究、空腹/喂食条件下的模拟肠道环境（FaSSIF）和胃液环境（FaSSGF）稳定性研究、血浆稳定性研究、微粒体稳定性研究、血浆蛋白结合（PPB）研究、血浆分配研究以及人工膜渗透性测定（PAMPA），还进行了原位单次通过肠道的渗透性研究（SPIP）。结果表明，FNR在肠道液中的溶解度更高，在FaSSIF和FeSSIF中的稳定性优于FaSSGF。在5 μM浓度下，FNR在大鼠肝脏微粒体中经过3小时和1小时的代谢后仍保持91.98%的稳定性。在5 μM和10 μM浓度下，血浆蛋白结合率分别为94.11%和96.97%，说明FNR在血液和血浆之间能够快速达到平衡。PAMPA和SPIP的结果表明FNR具有较高的被动渗透性。通过口服和静脉注射给药，FNR的绝对生物利用度为49.17%。FNR在体内的分布顺序为：肠道>肾脏>肺>脾脏>肌肉>心脏>大脑>胰腺>肝脏。所有这些体外和体内研究都为FNR的临床前应用提供了支持。
引言
Finerenone（FNR）的化学名为(S)-4-(3-氰基5-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-羧酰胺，分子量为378.43 g/mol（见图1(a)的化学结构）。Phenacetin的化学名为N-(4-乙氧基苯基)乙酰胺，用作所有实验中的内标（IS，见图1(b)）。FNR是一种新型的选择性非甾体盐皮质激素受体拮抗剂，用于治疗与糖尿病相关的慢性肾病[1][2][3][4][5]。与其他盐皮质激素受体拮抗剂（如螺内酯和依普利酮）相比，FNR具有不同的药理特性[6][7][8]。螺内酯效力较强但选择性较差，依普利酮选择性较高但效力较低，而FNR同时具备这两种特性[9]。盐皮质激素受体在肾脏、心脏和血管中表达，FNR能够有效抑制由盐皮质激素受体激活引起的炎症和纤维化。FNR对孕酮、雄激素、雌激素或糖皮质激素受体的结合亲和力较低，因此不会引起诸如男性乳腺发育等不良反应。FNR通过与特定受体配体复合物结合来阻断促炎和促纤维化信号的传导。与其他类固醇激素受体相比，FNR的半最大抑制浓度（IC50）为18 nM（而其他激素受体的IC50通常大于10 μM）[10]。FNR已在超过2000名患者的II期临床试验中用于慢性肾病和糖尿病肾病的治疗，使用过程中未观察到高钾血症或肾功能下降[11]。FNR还能抑制大鼠模型中的肾纤维化[12]，即使在类似的肾功能障碍和心脏功能障碍（收缩期和舒张期）情况下也能发挥保护作用[6][9][13][14][15][16][17]。FNR还可用于轻度或中度肝功能障碍的治疗[8]。FNR主要通过细胞色素P450（CYP3A4）代谢，CYP2C8的参与程度较低[18]。
文献调查显示，已有关于HPLC分析方法的报道。例如，S J Imran等人报道了一种FNR的分析方法：使用流动相乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（比例30:70），在Hemochrom C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）上以1 mL/min的流速进行分离[1]。Arulselvan等人使用流动相乙腈和正磷酸（比例70:30 v/v），在C18 X-bridge柱（150 mm×4.6 mm×3.5 μm）上以1 mL/min的流速进行分离[19]。
目前关于FNR的药代动力学（PK）研究和LC-MS/MS生物分析方法的相关数据非常有限。已有报道利用LC-MS/MS技术对人类血浆中的FNR进行生物分析，但这些方法主要采用沉淀法（PPT）处理样品。有一种LC-MS/MS方法可用于定量血浆和尿液中的FNR，其检测限（LLOQ）为100 ng/mL[1]。
在开展临床研究之前，首先通过体外和体内研究评估了FNR的疗效、安全性和毒性。本研究首次在大鼠体内进行了FNR的PK研究。为了了解药物的理化性质，进行了溶解度、稳定性、渗透性、血浆蛋白结合（PPB）等体外研究。通过不同途径给Sprague Dawley（SD）大鼠给药，以测定FNR的生物利用度，并研究了其组织分布（TD）、PPB和血浆蛋白结合系数（K_RBC/PL），从而评估药物在靶组织中的积累情况。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的规定，TD研究是评估非临床药代动力学的重要指标。截至目前，尚未有关于SD大鼠FNR的全面PK和TD研究的报道。
目前大多数文献都致力于开发FNR的HPLC分析方法。然而，尚未有关于FNR在SD大鼠体内使用LC-MS/MS进行生物分析方法开发和验证的报道。LC-MS/MS技术具有高灵敏度、良好的重复性和重现性，以及较高的色谱分辨率。据我们所知，目前尚无研究探讨FNR的体外和体内疗效数据。本研究的目的是探讨其药代动力学、pH依赖性稳定性、渗透性、血浆蛋白结合行为等特性。
本研究的主要内容包括LC-MS/MS方法的开发、验证及其在PK研究和TD研究中的应用。该方法相比传统方法具有更高的灵敏度（0.5 ng/mL）、更小的样品体积（50 μL）、更快的分析时间（4分钟），以及通过液-液萃取（LLE）方法实现更高的回收率。体外稳定性研究包括溶解度、模拟胃肠道稳定性、血浆稳定性、微粒体稳定性、血浆蛋白结合、SPIP和PAMPA等。
化学物质和试剂
FNR购自Molnova Chemical（美国）。Phenacetin、睾酮、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、尿苷-5-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）、Alamethicin、乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟购自Sigma Aldrich（美国密苏里州）。LC-MS/MS级别的乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）以及HPLC级别的叔丁基甲基醚（TBME）购自Merck Limited（印度孟买）。氢氧化钠、氯化钾（KCl）等试剂也来自同一公司。
UPLC上的生物分析方法验证
根据美国食品药品监督管理局（USFDA）的指南，FNR的生物分析方法已在UPLC上得到全面验证[20]。
溶解度研究
溶解度研究使用了多种缓冲液，包括SGF（pH 1.2）、SIF（pH 6.5）、Tris缓冲液（pH 7.4）、磷酸盐缓冲液、FaSSGF（pH 1.6）、FaSSIF-V2（pH 6.8）、FeSSIF-V2（pH 5.8）和去离子水（TDW）。将1 mg的FNR加入含有1 mL缓冲液的玻璃小瓶中（N=3），然后在37°C下振荡培养24小时。随后将样品以11000 rpm的速度离心10分钟，取上清液并与等量的乙腈混合。
质谱条件
FNR的定量使用API 4000 Q-trap质谱仪完成，该质谱仪配备了ESI源。通过输液泵直接注入溶液来优化FNR及其内标的化合物和源参数。首先调整FNR和内标的极性，以确定正负模式的强度和稳定性。FNR和内标的化合物及源参数详见表1。
UPLC上的生物分析方法验证
生物分析方法按照USFDA指南进行了验证。血浆样品的提取过程与LC-MS/MS中的方法相同，先采用沉淀法（PPT），再通过液-液萃取（LLE）提高提取效率。
溶解度研究
溶解度研究对于FNR的口服吸收非常重要。研究发现，FNR在FaSSGF中的溶解度显著高于其他缓冲液，具体结果见补充表表S7。
胃肠道稳定性
使用FaSSGF、FeSSIF和FaSSIF等生物相关缓冲液评估了FNR的胃肠道稳定性。结果显示，在1小时和3小时的孵育条件下，FNR在SGF和SIF缓冲液中的溶解度和稳定性均较高。
结论
本研究首次使用LC-MS/MS在大鼠血浆中验证了一种高灵敏度、稳健且可重复的生物分析方法，用于FNR的定量。该方法采用液-液萃取技术，无明显的基质效应，回收率、准确性和精密度均符合要求，样品体积小，分析时间短（4分钟）。浓度范围为0.5–500 ng/mL的线性关系良好，准确度也在可接受范围内。稳定性研究也表明该方法具有可靠性。
作者贡献声明
Shivam Rathaur：撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、概念构建。
Parag Varshney：数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、软件应用、方法学研究、数据分析。
Debalina Maity：数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、软件应用、方法学研究、数据分析。
Jiaur R. Gayen：撰写部分。
动物权利
所有涉及动物的实验均遵循CDRI的机构动物伦理委员会规定（批准编号：IAEC/2022/102/更新日期：2023年11月30日）。
资金来源
本研究未获得任何公共机构、商业机构或非营利组织的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢印度新德里的CSIR提供的资金支持，以及CSIR-CDRI主任的持续鼓励和支持。CSIR-CDRI的通信编号为181/2025/JRG。
