在一个表现出低胆固醇血症的家庭中鉴定出一种新的apoB变体：机制层面的见解

《Journal of Clinical Lipidology》：Identification of a novel apoB variant in a family exhibiting hypocholesterolemia: mechanistic insights

家族性低β脂蛋白血症研究中发现，三个受累个体APOB基因exon3 1268位腺苷缺失导致 frameshift突变，产生仅含前397个氨基酸的apoB9蛋白，该蛋白因缺乏β折叠结构无法正常分泌，循环中apoB水平下降50-60%，可能降低心血管疾病风险。

　　

拉希德·埃萨拉马尼（Rachid Essalamani）| 亚历山德拉·埃瓦杰利迪斯（Alexandra Evagelidis）| 安娜·鲁布佐娃（Anna Roubtsova）| 迈克尔·钟（Michael Chong）| 纳齐娅·帕坦（Nazia Pathan）| 吉约姆·帕雷（Guillaume Pare）| 叶夫根尼·V·彼得罗琴科（Evgeniy V. Petrochenko）| 马特·赖蒙德（Mart Reimund）| 艾伦·T·雷梅利（Alan T. Remaley）| 洛林·查利富尔（Lorraine Chalifour）| 莫里斯·施韦策（Morris Schweitzer）| 纳比尔·G·塞达（Nabil G. Seidah）

蒙特利尔临床研究所（IRCM），隶属于蒙特利尔大学，生物化学神经内分泌学实验室，加拿大魁北克省蒙特利尔市H2W 1R7

摘要

背景

家族性低β-脂蛋白血症是一种罕见的常染色体共显性遗传疾病，通常由负责脂蛋白形成和分泌的apoB蛋白生成缺陷引起。

目的

研究三名家族成员的血脂谱，这些成员的循环胆固醇水平极低。

方法

分析了对照组兄弟姐妹和患病患者的血浆。使用FPLC/HPLC技术来表征血脂谱、脂蛋白颗粒的大小和分布。对家族成员进行的外显子测序发现，在三名患者中存在APOB基因的单个核苷酸缺失。在IHH细胞中分析了该单核苷酸缺失对apoB分泌的影响。

结果

血浆血脂谱显示，患病个体的总胆固醇和LDL-胆固醇脂蛋白水平较低，但脂蛋白颗粒大小没有差异。APOB基因的DNA测序显示，在所有患者中，3号外显子的第1268位核苷酸处存在一个杂合子缺失。这种缺失导致第380位的谷氨酰胺发生读码框移位，从而在397位产生终止密码子。这种C端截短的apoB蛋白（称为apoB9）仅占全长蛋白的约9%。在IHH细胞中表达apoB9时，该蛋白无法从内质网（ER）/高尔基体释放到血液中。分子模型显示，apoB9缺乏形成脂蛋白颗粒所需的βA和βB结构域，这可以解释apoB9无法分泌的原因。

结论

我们的数据表明，患病家族成员的apoB水平比正常人低约50-60%，这可能使他们免于患动脉粥样硬化和心血管疾病的风险。

引言

载脂蛋白B（apoB）负责在血浆中运输脂质，包括胆固醇，是乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、脂蛋白(a) [Lp(a)]、中间密度脂蛋白（IDL）和低密度脂蛋白（LDL）的主要成分。其检测常用于评估动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）的风险。1, 2 载脂蛋白B100（apoB100）是LDL的主要蛋白质成分，是LDL受体（LDLR）的配体。3 apoB100、LDLR和PCSK9的突变会导致家族性高胆固醇血症（FH），这是一种常染色体共显性遗传病，其特征是LDL-胆固醇（LDLc）水平显著升高，CVD风险增加。4, 5 然而，作为CVD的生物标志物，apoB的水平比LDLc更具有预测价值。6, 7 因此，在临床护理中，apoB是评估apoB脂蛋白相关CVD风险及降脂治疗效果的首选指标。8

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-凯辛9（PCSK9）是一类参与多种生理和病理过程的分泌蛋白酶家族的第九个成员。9 当发现其功能获得性（GOF）变异与LDLc水平显著升高相关时，PCSK9在CVD中的作用变得明显。4 这一机制的机制在于，肝细胞来源的循环PCSK9以非酶促方式增强内体/溶酶体中LDLR的降解，导致含有apoB的脂蛋白清除减少，从而使LDLc和apoB水平升高。10

APOB基因位于人类2号染色体的短臂（2p24.1）上，包含43 kb的序列，包含29个外显子和28个内含子。它编码一种由4563个氨基酸组成的大型疏水性蛋白（包括27个氨基酸的信号肽）。3, 11 最近报道了两种apoB100在LDL上的冷冻电子显微镜结构。12, 13 其中一种结构揭示了apoB100与LDLR结合的详细情况，包括apoB100与LDLR之间界面的高分辨率结构。12 这些数据还有助于更好地理解已知的功能丧失（LOF）突变，这些突变发生在apoB100或LDLR上，与LDLc水平升高相关，且位于LDL-LDLR界面。12 循环中的apoB有两种异构体：一种来自肝细胞，另一种是肠道特异性的apoB48，由mRNA编辑产生。循环中的apoB100（28-4563个氨基酸；分子量约550 kDa）和apoB48（28-2179个氨基酸；分子量约264 kDa）分别占全长apoB100蛋白的100%和48%。apoB100与VLDL、IDL和LDL相关，而apoB48仅存在于CM中。

apoB是CVD风险的重要标志物，因为它存在于致动脉粥样硬化的脂蛋白颗粒中。循环中apoB水平的升高与高脂血症和动脉粥样硬化直接相关。APOB基因的变异是家族性高胆固醇血症（FH）的第二大常见原因（14%），而LDLR和PCSK9基因的变异分别占67%和2%。4, 14 APOB基因中最常见的变异发生在LDLR结合域，该域包含2,992-3,561个氨基酸。15 主要结合位点位于3,386–3,396位，另一个较次要的结合位点位于3,174-3,184位也可能起作用。16 然而，许多apoB致病性变异也发生在这些位点之外，例如在家族性缺陷载脂蛋白B中常见的R3527Q和R3537W变异。17 这些变异影响apoB100与LDLR的结合能力，从而降低LDLc的清除。实际上，携带apoB LOF变异的脂蛋白颗粒无法有效从血液中清除，15 导致循环中LDLc水平升高，增加动脉粥样硬化和心脏病发作的风险。FH患者的治疗包括使用降胆固醇药物（如他汀类药物、依折麦布和PCSK9抑制剂）以及生活方式的改变，18 但缺乏LDLR的纯合子FH患者通常采用血浆置换疗法。19 然而，最近的研究表明，FDA批准的ANGPTL-3抑制剂（如单克隆抗体evinacumab）也对这些患者有效，20 为对传统疗法无反应的FH患者提供了重要治疗选择。

相比之下，家族性低β-脂蛋白血症（FHBL）的特点是循环中LDLc和apoB水平异常低。FHBL由编码微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）21或apoB的基因突变引起，这两种蛋白对于脂蛋白的生成和组装至关重要。22 APOB的LOF突变通常导致APOB mRNA翻译提前终止，产生截短且无功能的蛋白，从而导致LDLc水平降低。23, 24 在人类中，已报道多种截短的apoB形式，其分子量从全长apoB100的9%（apoB9）到89%（apoB89）不等。25, 26, 27 研究表明，apoB的C端截短会影响生成的脂蛋白的大小和命运。事实上，apoB长度减少10%会导致脂蛋白核心密度降低13%，表明C端截短会降低apoB的脂质招募能力，从而影响蛋白稳定性。28, 29 apoB C端片段的长度影响其分泌，只有长度超过27%的截短形式（apoB27）才能有效分泌到血浆中。30, 31 最近的研究发现，一种不涉及截短的错义突变L343V导致apoB分泌减少约50%。32

在本研究中，我们发现了三名循环胆固醇水平极低的家族成员。对其血浆血脂谱的分析显示，这些个体的LDLc水平极低，但脂蛋白颗粒大小正常。有趣的是，他们的DNA中未发现LDLR或PCSK9的变异（未显示）。相比之下，对照组（未患病的姐妹）和三名患者（患者父亲及其独子和女儿）的APOB基因测序显示，在3号外显子的第1268位存在一个腺苷的杂合子缺失。这种缺失导致第380位的谷氨酰胺发生读码框移位，从而在397位产生终止密码子。这种C端截短的apoB仅占全长蛋白的约9%（397个氨基酸；称为apoB9）。在人类肝细胞IHH细胞中表达apoB9时，发现其细胞内形式的最大分子量约为60 kDa，无法从内质网/高尔基体释放到血液中。这些结果表明，患病家族成员循环中apoB水平的降低（通过蛋白质组学估计为-68%）可能降低了他们患CVD的风险。

细胞培养和转染

原始人类肝细胞IHH细胞在William’s Medium（ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养，添加10%胎牛血清（FBS；GIBCO BRL ON，加拿大）和1%青霉素-链霉素（Sigma，ON，加拿大）。细胞在37°C、5% CO₂条件下培养。为了生成双标记的apoB21，将pIRES载体（Clontech，美国加利福尼亚州）修改为插入3xHA和V5标签。通过PCR扩增apoB21 cDNA（编码965个N端氨基酸），然后用XhoI和Agel限制性内切酶进行消化。

识别具有低LDLc及apoB100、apoC3、apoC2和apoE水平家族性低β-脂蛋白血症的家族成员

一名68岁的白人男性因常规体检就诊。他的血脂谱显示LDLc水平极低，为0.37 mmol/L（表1）。患者被转诊至专科脂质诊所进行进一步检查。体检结果正常，未发现肝肿大。

由于他们的胆固醇水平较低，我们还对一级亲属进行了LDLc水平的筛查（表1）。一名39岁的女儿

讨论

APOB基因的突变会导致apoB100蛋白的缺陷形式，而apoB100在脂蛋白颗粒中负责运输胆固醇。这会导致LDLc在血液中积聚，从而增加早发性CVD的风险。迄今为止，已报告超过4661种APOB基因变异，其中大多数是错义突变（2686；58%）或读码框突变（117；0.03%）。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=%22apoB%22%5BGENE%5D&redir=gene

结论

本研究结果表明，所研究的患病家族成员可能免于患动脉粥样硬化和各种CVD的风险。事实上，研究表明，apoB比LDLc更能预测心血管事件（如心脏病发作和中风）。6, 7, 8

伦理批准和参与同意

伦理委员会名称：医学/生物医学研究伦理委员会；批准代码/编号2018-829，17-170；批准日期：2018年1月17日。所有参与者在入组前均获得了书面知情同意。所有参与者均签署了各自的同意书。

资金

本研究由CIHR资助（N.G.S.：# 148363；191678）、加拿大前体蛋白酶研究主席职位（N.G.S.：# 950-231335）以及辉瑞公司的研究者启动资金（资助M.S.）。M.R.和A.T.R.的研究资金得到了国家心肺血液研究所（NHLBI）的内部研究计划和Leducq基金会及Leducq心血管研究基金会的支持。

作者贡献声明

洛林·查利富尔（Lorraine Chalifour）：方法学、资金获取。莫里斯·施韦策（Morris Schweitzer）：写作-审稿与编辑、可视化、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。马特·赖蒙德（Mart Reimund）：方法学、数据管理。艾伦·T·雷梅利（Alan T. Remaley）：可视化、方法学、数据管理。拉希德·埃萨拉马尼（Rachid Essalamani）：写作-初稿、可视化、方法学、数据分析、概念化。安娜·鲁布佐娃（Anna Roubtsova）：方法学。

写作过程中未使用生成式AI或AI辅助技术

作者声明在撰写本手稿过程中未使用任何生成式AI或AI辅助技术。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Jisca Borgela在准备本手稿中的专业秘书协助，以及IRCM测序设施的Myriam Rondeau和Sarah Boissel的帮助。

出版同意

所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。