通过重新编程免疫抑制微环境并抑制免疫逃逸，开发出用于光热增强化学动力免疫疗法的生物杂交体

《Journal of Colloid and Interface Science》：Engineered biohybrids for photothermally enhanced chemodynamic-immunotherapy through reprograming immunosuppressive microenvironment and inhibiting immune evasion

本设计通过工程化大肠杆菌表面共表达乳酸氧化酶（LOX）和程序性死亡1（PD1）蛋白，并修饰铜硫化物纳米粒子（CuS NPs），构建生物混合体BLPC。LOX消耗乳酸生成过氧化氢，结合CuS NPs在近红外光照射下的光热效应增强Fenton反应，产生高毒性羟基自由基，促进免疫原性细胞死亡和抗原释放，激活抗肿瘤免疫应答。同时，乳酸消耗逆转免疫抑制微环境，PD1蛋白阻断PD1/PD-L1通路，抑制免疫逃逸，协同增强化疗和免疫治疗效果，为三阴性乳腺癌治疗提供新策略。

　　

徐书静|李月伟|李建森|宋张志|邢素欣|王国成|戴新宇|朱春峰|王胜

天津大学医学院生命科学学院，中国天津300072

摘要

化学动力学免疫疗法的治疗效果受到羟基自由基生成不足和肿瘤微环境抑制免疫作用的限制。本研究设计了一种工程化的大肠杆菌，在其表面同时表达乳酸氧化酶（LOX）和程序性死亡1（PD1）蛋白。随后，这种工程菌被改造成含有硫化铜纳米颗粒的生物杂化体（简称BLPC）。BLPC表面的LOX可以消耗乳酸并生成过氧化氢。在近红外光照射下，硫化铜纳米颗粒的光热效应能够进一步增强芬顿反应的效率，从而提高化学动力学疗法的效果，诱导有效的免疫性细胞死亡并激活免疫反应。同时，乳酸的消耗可以逆转肿瘤微环境的抑制作用。此外，BLPC表面的PD1蛋白通过阻断程序性死亡配体1（PD-L1）/PD1通路来抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，进一步增强免疫治疗效果。因此，这种工程化生物杂化体为三阴性乳腺癌的多模式治疗提供了一种有前景的策略。

引言

近年来，利用患者自身免疫系统对抗肿瘤的免疫疗法已成为一种有前景的肿瘤治疗策略[1]、[2]、[3]。某些治疗方法通过诱导免疫性细胞死亡（ICD）和释放损伤相关分子模式（DAMPs）及肿瘤相关抗原[4]、[5]、[6]来激活免疫系统。例如，化学动力学疗法（CDT）可以通过芬顿反应将内源性过氧化氢（H?O?）转化为高细胞毒性的羟基自由基（•OH），从而杀死肿瘤细胞，这是一种诱导ICD的新策略[7]、[8]、[9]、[10]。因此，化学动力学免疫疗法代表了肿瘤治疗的一种有前景的方法。然而，由于肿瘤微环境（TME）中H?O?的不足，CDT过程中产生•OH和激活免疫反应的效率仍然不够理想[11]、[12]。此外，过多的乳酸代谢物积累[13]、[14]以及过表达的程序性死亡配体1（PD-L1）蛋白会抑制肿瘤特异性T细胞的功能[15]、[16]，从而降低化学动力学免疫疗法的整体治疗效果。

为了提高•OH的生成量，人们开发了多种提高TME中H?O?水平的方法[17]、[18]。其中，乳酸氧化酶（LOX）受到了广泛关注，它不仅可以通过增加H?O?的含量来增强CDT的治疗效果[19]、[20]，还可以通过消耗乳酸来逆转肿瘤微环境的抑制作用[21]、[22]。因此，用于输送LOX的治疗平台受到了广泛关注。除了提高•OH的生成量外，增强T细胞的免疫反应也是提高化学动力学免疫疗法效果的关键策略[4]、[23]。目前，通过输送单克隆抗体来阻断程序性死亡1（PD1）/PD-L1通路已成为抑制肿瘤细胞免疫逃逸的有效免疫治疗策略[24]、[25]。然而，将LOX和PD-L1抗体稳定地输送到TME中仍然具有挑战性。研究表明，细菌能够靶向并定植于缺氧和营养丰富的TME环境中[26]、[27]。此外，利用基因工程技术，可以设计细菌来输送治疗分子，为肿瘤治疗提供了一种潜在的方法[28]、[29]、[30]。因此，开发能够同时表达功能性蛋白的工程菌是一种克服上述问题的有前景策略。

在本研究中，设计了一种名为BL21-LOX-PD1-CuS（BLPC）的工程化生物杂化体，用于有效的化学动力学免疫疗法（图1）。为了构建BLPC，首先将大肠杆菌（E. coli）工程化使其表面同时表达LOX和PD1蛋白，得到表达LOX和PD1的BL-LOX-PD1（BLP）菌株。随后，用硫化铜（CuS）纳米颗粒对BLP进行修饰，这些纳米颗粒既可作为芬顿反应的催化剂[31]、[32]，也可作为光热转换剂[33]、[34]、[35]（图1 A）。BLPC表面的LOX可以消耗乳酸生成H?O?，为芬顿反应提供足够的底物。在近红外（NIR）光照射下，CuS纳米颗粒的光热效应可以进一步促进芬顿反应的效率，加速•OH的生成（图1 B）。这种双重增强作用可以进一步诱导ICD，释放DAMPs并促进树突状细胞（DCs）的成熟，从而触发强烈的抗肿瘤免疫反应（图1 C）。此外，乳酸的消耗可以逆转肿瘤微环境的抑制作用，BLPC表面的PD1蛋白可以阻断PD1/PD-L1通路，增强肿瘤特异性T细胞的免疫反应，从而提高免疫疗法的效果（图1 D）。因此，这种工程化生物杂化体通过增强CDT的效果和重塑肿瘤微环境的抑制作用，实现了有效的多模式抗肿瘤治疗，为免疫疗法的发展提供了有前景的策略。

材料与仪器

BL21（BL）感受态大肠杆菌细胞购自Tsingke公司。clya、pd1、inp和lox基因由BGI基因组公司合成。CuCl?·2H?O（99%）、硫代乙酰胺（98%）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，98%）购自HEOWNS公司。SH-PEG（2000）-NH?（≥95%）购自重庆玉溪制药公司。3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB，98%）购自Meryer公司。3-(乙基亚氨基甲基亚胺)-N,N-二甲基丙-1-胺（EDC，99%）购自Energy公司。

BLPC的制备与表征

细胞溶素A（ClyA）和整合核蛋白（INP）是大肠杆菌的膜蛋白，可作为两种不同的表面展示支架[38]。在本研究中，我们分别通过ClyA和INP使BL菌株表面同时表达PD1蛋白和LOX蛋白。如图2A所示，构建了由T7启动子驱动的pETDuet-PD1-LOX质粒（基因序列见表S1）。随后，将pETDuet-PD1-LOX质粒转入BL菌株中。

结论

本研究开发了一种名为BL21-LOX-PD1-CuS（BLPC）的工程化生物杂化体，以克服化学动力学免疫疗法的局限性。该杂化体由表达乳酸氧化酶（LOX）和程序性死亡1（PD1）的大肠杆菌以及硫化铜纳米颗粒组成。一方面，BLPC表面的LOX可以消耗乳酸并生成H?O?，从而增强化学动力学疗法（CDT）的效果并逆转肿瘤微环境的抑制作用；另一方面，PD1蛋白

作者贡献

本文由所有作者共同完成。所有作者均对最终稿件内容表示认可。

作者贡献声明

徐书静：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理、概念构思。李月伟：方法学设计、实验实施。李建森：方法学设计。宋张志：实验实施。邢素欣：方法学设计。王国成：实验实施。戴新宇：实验实施。朱春峰：方法学设计。王胜：撰写、审稿与编辑、资金申请。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2024YFA1210100）和中国国家自然科学基金（项目编号82372100）的支持。