《Small》：Macrophage Phenotype–Dependent Protein Corona Formation Governs Ligand Accessibility and Immune Clearance of Biomimetic Nanoparticles
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本研究系统揭示了不同表型（M0、M1、M2）巨噬细胞膜包被的磁性二氧化硅纳米颗粒（SMNs）在体内的清除行为及其中蛋白冠（PC）形成所起的关键作用。研究发现，相较于M1和M2型，M0巨噬细胞膜包被的纳米颗粒（M0@SMNs）展现出最优的免疫逃逸能力、最长的血液循环时间和最低的肝脏清除率。其机制在于M0膜显著减少了免疫调理素（C3、IgG、IgM）的吸附并抑制了补体激活，而纳米流式细胞术（NanoFCM）分析表明蛋白冠可掩蔽高达约40%的表面膜蛋白。该研究为基于细胞表型调控纳米颗粒生物命运并理性设计仿生纳米载体提供了重要指导。
引言
纳米医学在提升药物溶解度、延长系统循环时间以及实现靶向递送方面展现出巨大潜力。其中，利用天然细胞膜包被的仿生纳米颗粒（CM-NPs）因其优异的生物相容性、免疫逃逸能力和靶向性而备受关注。巨噬细胞膜因其固有的炎症归巢能力和低免疫原性成为一种有前景的包被来源。巨噬细胞具有显著的表型可塑性，可极化为M0（初始）、M1（促炎）和M2（抗炎）亚型，每种亚型具有独特的膜蛋白组成和免疫功能。然而，巨噬细胞表型如何影响纳米颗粒进入体内后血清蛋白在其表面形成蛋白冠（PC），并进而调控其免疫识别与清除命运，尚待深入研究。
制备与表征
研究首先通过不同刺激因子将RAW264.7巨噬细胞极化为M1（LPS刺激）和M2（IL-4刺激）表型，并通过形态学观察、Western blot（WB）和流式细胞术（FCM）验证了极化效率。通过逆微乳液法合成了磁性二氧化硅纳米颗粒（SMNs），并通过超声融合技术成功制备了分别包被M0、M1和M2型巨噬细胞膜的SMNs（M0@SMNs, M1@SMNs, M2@SMNs）。表征结果显示，包膜后纳米颗粒的水合动力学直径（Dh）略有增加，但所有M@SMNs均保持良好的胶体稳定性。纳米流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析证实了膜包被的高效性，SDS-PAGE和WB分析进一步表明不同表型来源的膜蛋白谱及其特异性标志物（如M1的CD86和M2的CD206）在包被后得以成功保留。
体外巨噬细胞摄取
细胞毒性实验表明，所有M@SMNs在10–200 μg mL?1浓度范围内均表现出良好的生物相容性。流式细胞术和CLSM分析显示，巨噬细胞膜包被普遍降低了RAW264.7细胞对纳米颗粒的摄取，其中M0@SMNs的摄取量显著低于M1@SMNs和M2@SMNs。进一步研究发现，在不同表型的巨噬细胞（M0、M1、M2）以及不同来源的巨噬细胞系（J774a.1, THP-1）中，M1@SMNs在M1型巨噬细胞中的摄取最高，而M0@SMNs在各种条件下均表现出最低的摄取量。内吞途径分析表明，裸SMNs主要通过网格蛋白介导的内吞途径被摄取，而M@SMNs则通过多种途径内化，其中M0@SMNs和M2@SMNs主要依赖小窝蛋白介导的内吞，而M1@SMNs则更依赖于网格蛋白介导的内吞。?1. (E) CLSM images showing uptake. (F) FCM analysis of uptake by different macrophage types. (G) FCM analysis of endocytic pathways.">
体内清除机制
体内生物分布研究表明，肝脏是纳米颗粒的主要清除器官。与裸SMNs相比，所有M@SMNs的肝脏积累均减少，其中M0@SMNs的减少最为显著（约29%），且其肝脏荧光信号最低。对肝脏细胞亚群的进一步分析显示，库普弗细胞（Kupffer cells）是摄取纳米颗粒的主要细胞类型。M0@SMNs被库普弗细胞摄取的比例最低（32%），而M1@SMNs最高（85%）。在血液免疫细胞中，中性粒细胞和T细胞是清除纳米颗粒的主要贡献者，M0@SMNs在所有免疫细胞亚群中的平均荧光强度（MFI）均最低，显示出最佳的免疫逃逸能力。相应地，M0@SMNs在注射后1小时在血液中的保留率最高。
蛋白冠形成分析及其对摄取的影响
尽管细胞膜包被降低了血清蛋白的吸附总量，但所有M@SMNs在血清孵育后仍会形成蛋白冠。体外摄取实验发现，在未形成蛋白冠的情况下，M0@SMNs被RAW264.7细胞摄取最多，但蛋白冠形成后，所有M@SMNs的巨噬细胞摄取均显著增加，其中M1@SMNs和M2@SMNs的摄取增幅最大。值得注意的是，预先与乳腺癌血清或高脂血症血清孵育形成病理相关蛋白冠后，M1@SMNs的摄取甚至超过了裸SMNs。
蛋白冠形成对膜蛋白可及性的影响
利用纳米流式细胞术在单颗粒水平上评估了蛋白冠对功能膜蛋白的掩蔽效应。结果表明，血清孵育导致颗粒尺寸分布右移，证明蛋白冠的形成。在所有颗粒中，裸SMNs具有最高的血清蛋白覆盖率和覆盖程度，而M0@SMNs的覆盖率最低，且低覆盖度（0%–25%）的颗粒比例最高。更重要的是，血清孵育后，M1@SMNs上CD86抗体和M2@SMNs上CD206抗体的结合率分别从22%和24%下降至15%和14%，表明蛋白冠分别掩蔽了约32%和42%的表型特异性膜蛋白配体。
蛋白冠组成分析与补体激活
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析揭示了蛋白冠组成的表型依赖性差异。与裸SMNs相比，膜包被减少了中等分子量和带正电荷蛋白的吸附。在所有M@SMNs中，M0@SMNs吸附的凝血相关蛋白和免疫球蛋白水平最低，而M1@SMNs显著富集了组氨酸富含糖蛋白（Hrg）。Western blot分析进一步证实，M0@SMNs吸附的补体C3、IgG和IgM水平最低，而M1@SMNs的吸附水平最高。酶联免疫吸附测定（ELISA）结果显示，M0@SMNs在人血清和小鼠血清中触发的补体激活产物C3a和C5a水平均为最低。这些结果共同表明，M0膜包被通过减少免疫调理素的吸附和抑制补体级联激活，赋予了纳米颗粒最佳的“隐身”性能。
结论
本研究系统阐明了巨噬细胞膜表型依赖性蛋白冠的形成及其对仿生纳米颗粒清除行为的调控机制。在三种表型中，M0@SMNs展现出最显著的免疫逃逸能力，包括最低的体外巨噬细胞摄取、最长的体内血液循环时间以及最低的库普弗细胞清除。蛋白冠的形成会掩蔽部分表面膜蛋白，改变纳米颗粒的生物识别。机制上，M0@SMNs吸附的免疫调理素（C3、IgG、IgM）最少，引发的补体激活最弱。这些发现表明，来源细胞的表型决定了蛋白冠的组成和清除命运，并确立了M0巨噬细胞作为构建长循环纳米载体的优选膜来源。
