《Journal of Dermatological Science》：Identification of Novel Small Molecule Compounds with Readthrough Activity in Nagashima-Type Palmoplantar Keratosis
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本文聚焦Nagashima型掌跖角化症（NPPK）的治疗困境。该疾病主要由SERPINB7基因的无义突变（p.Arg266Ter）导致，产生提前终止密码子（PTC）。目前药物疗效有限，研究人员通过高通量筛选，发现了具有通读（readthrough）活性的新型小分子化合物。结果显示，这些化合物（如#2、A7、A8）在体外对UGAA和UAAG型PTC显示出优于庆大霉素（gentamicin）和ataluren的通读效力，部分恢复了SERPINB7全长蛋白表达，为NPPK乃至其他由无义突变引起的遗传病提供了潜在的治疗新策略。
想象一下，你身体里的蛋白质合成工厂（核糖体）正在辛勤地工作，根据基因蓝图制造蛋白质。突然，蓝图上一个错误的“句号”（科学家称之为提前终止密码子，Premature Termination Codon， PTC）让生产线戛然而止，只生产出一半的“残次品”（截短蛋白），而那个本该完整发挥功能的全长蛋白却无法产生。这种“句号”错误，在遗传学上被称为无义突变（nonsense mutation），导致了大约11%的遗传疾病。
永岛型掌跖角化症（Nagashima-type palmoplantar keratosis， NPPK）就是这样一个典型例子。它是东亚人群中最常见的遗传性掌跖角化病，超过90%的患者都携带同一个“坏句号”：SERPINB7基因上的p.Arg266Ter突变。这个突变创造了一个UGA类型的PTC，导致功能性SERPINB7蛋白的缺失，从而引发手脚皮肤严重角化增厚的症状。虽然外用药物如维生素D3有一定帮助，但效果有限，患者亟待更有效的疗法。
如何修正这个“句号”错误呢？一个充满希望的方向是“通读”（readthrough）疗法。这种疗法的核心思想是，让核糖体“无视”或“跳过”这个错误的停止信号，继续翻译，从而产生有功能的全长蛋白。一些已知的药物，如氨基糖苷类抗生素庆大霉素（gentamicin）和一种名为ataluren的小分子药物，被报道具有这种能力。然而，庆大霉素有潜在的耳毒性和肾毒性风险，而ataluren的疗效和机制一直存在争议，且在欧盟对杜氏肌营养不良症（DMD）的授权申请也因未能证实有效性而被拒绝。因此，寻找更安全、更高效的新型通读化合物，成为了一个关键的医学需求。
这项由日本北海道大学的研究团队开展的工作，正是为了解决这一问题。他们希望通过系统性的筛选，找到能够高效促进PTC通读的新型小分子化合物，为NPPK以及更多由无义突变引起的遗传病带来新的治疗曙光。该研究成果发表在皮肤科学领域的专业期刊《Journal of Dermatological Science》上。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术。首先是建立了基于荧光素酶（Firefly luciferase， Fluc）的高通量筛选（high-throughput screening）系统，用于从近两万种化合物库中初筛有潜力的分子。其次，为了验证初筛结果在疾病相关背景下的有效性，他们构建了携带p.Arg266Ter突变的FLAG标签SERPINB7表达载体，在U2OS和HaCaT（人永生化角质形成细胞）等细胞系中进行瞬时转染和蛋白质印迹（Western blot）分析，直接检测全长SERPINB7蛋白的恢复情况。此外，他们还使用了海肾荧光素酶（Renilla luciferase， RLuc）报告基因系统来量化通读效率，并运用了MTT、CellTiter-Glo?2.0和流式细胞术（DAPI/PI）等多种方法评估化合物的细胞毒性。研究中也利用了定点突变技术合成了12种不同PTC（UAA， UAG， UGA）与+4核苷酸组合的突变体，以测试化合物对不同序列上下文的通读特异性。
研究结果
3.1. 高通量筛选鉴定出潜在的通读化合物
研究人员建立了一个以UAAC（UAA PTC， +4位为C）为靶点的高通量通读检测系统。在筛选了近2万种小分子化合物后，他们初步锁定了130种能使荧光信号增强至少4倍的化合物，约占筛选总数的1%。
3.2. 在NPPK背景下评估通读效率
为了验证这些初筛化合物在疾病相关环境中的效果，研究人员构建了携带p.Arg266Ter（UGAA）突变的SERPINB7表达载体。通过蛋白质印迹分析，在64种候选化合物中，有两种（编号#2和#3）在30 μM浓度下显示出明显的通读活性，能够恢复全长SERPINB7蛋白的表达，且这种恢复作用呈现剂量依赖性。
3.3. 具有相似化学结构和可比通读效果的化合物
有趣的是，#2和#3具有相似的化学结构。基于此，研究人员进一步从化合物库中找到了12个结构相似的分子进行测试。最终，三个化合物（#2， A7， A8）被确定为最终的有效化合物，它们都能以剂量依赖的方式促进全长SERPINB7的合成。这三个化合物共享一个类似的核心化学结构。
3.4. 有效化合物显示出比庆大霉素或ataluren更高的通读效率
在相同的实验条件下，将#2， A7， A8与目前用于通读治疗的药物庆大霉素（800 μg/mL）和ataluren（3 μM）进行对比。结果显示，这三个有效化合物均能检测到明显的通读活性，而庆大霉素和ataluren在此次检测中效果微乎其微。
3.5. 有效化合物对UGAA或UAAG终止密码子显示出通读效率
通读效率不仅取决于PTC本身（UGA， UAG， UAA），还受其下游第一个核苷酸（即+4位核苷酸）的影响。研究人员测试了这三个化合物对不同PTC与+4核苷酸组合的通读效果。结果表明，这些化合物在诱导通读方面是有效的，尤其是对UGAA或UAAG类型的提前终止密码子。其中，化合物A8在UGAA-PTC上显示出比其他两种化合物更高的效力。
3.6. 化合物的细胞毒性
通过MTT、CellTiter-Glo?ATP检测和DAPI流式细胞术三种互补的活力测定方法评估了化合物在测试浓度下的细胞毒性。综合结果表明，这些化合物仅表现出轻微的细胞毒性。
3.7. 在角质形成细胞中恢复SERPINB7表达
为了在更贴近疾病状态的细胞类型中评估通读效果，研究人员在HaCaT角质形成细胞中进行了实验。定量比较显示，化合物#2能将突变细胞中的全长SERPINB7蛋白恢复到野生型表达水平的约6.25–12.5%。使用RLuc报告系统进一步证实，在HaCaT细胞中，32 μM的化合物#2能将通读信号（相对于野生型）从对照的2.03%提升至7.07%。
3.8. 化合物#2对规范终止密码子的抑制作用
研究人员还评估了化合物#2是否会影响正常（规范）终止密码子的翻译终止。他们在正常SERPINB7终止密码子下游插入了3×HA标签。实验发现，用32 μM化合物#2处理细胞后，能检测到HA信号，表明该化合物也能抑制规范终止密码子，导致翻译过程“超读”。
研究结论与讨论
本研究通过高通量筛选，发现了一系列能够有效促进PTC通读的新型小分子化合物（#2， A7， A8）。这些化合物在体外实验中展现出了比现有药物庆大霉素和ataluren更强的通读效力，特别是在针对NPPK相关的UGAA型PTC时。在疾病相关的角质形成细胞模型中，化合物#2能部分恢复SERPINB7蛋白的表达水平。
这项研究的重要意义在于：
第一，它为目前缺乏有效治疗手段的Nagashima型掌跖角化症（NPPK）提供了一种全新的潜在治疗策略——通读疗法，直接针对疾病的遗传根源。
第二，所发现的化合物核心化学结构明显不同于已知的氨基糖苷类（如庆大霉素）和ataluren，暗示其可能通过一种全新的机制发挥作用，为未来药物研发开辟了新方向。
第三，这些化合物对UGAA和UAAG等特定序列的PTC显示出高效力，意味着它们可能不仅适用于NPPK，还有潜力应用于其他由类似无义突变引起的广泛遗传病。
当然，研究也指出了当前化合物的局限性：恢复的蛋白水平（6.25-12.5%）可能不足以满足体内治疗需求；存在轻微细胞毒性；最关键的是，化合物#2对规范终止密码子也有抑制作用，这可能导致产生异常延长的蛋白质，带来不可预知的风险。因此，未来的研究重点将是对这些“先导化合物”进行化学结构优化，旨在提高其通读效力、选择性和安全性，减少对规范终止的干扰，最终推动其向临床应用发展。
总而言之，这项研究不仅为一种特定皮肤遗传病的治疗带来了希望，更通过发现全新结构的高效通读小分子，为整个由无义突变引发的遗传病治疗领域贡献了重要的候选分子和研发思路。
