《Journal of Dairy Science》：The E3 ubiquitin ligase NEDD4 protects against nonesterified fatty acid–induced hepatic inflammatory injury in ketotic cows
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本研究为解决奶牛酮病中非酯化脂肪酸（NEFA）诱导的肝脏炎症损伤问题，揭示了E3泛素连接酶NEDD4通过靶向受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1），促进其泛素化降解，从而抑制NF-κB通路激活、减轻炎症的关键作用，为理解酮病肝脏损伤的分子机制和潜在治疗靶点提供了新见解。
奶牛在产犊后，常常会面临一种名为“酮病”的代谢挑战。想象一下，一头高产奶牛就像一座高强度运转的工厂，产奶需要巨大的能量投入。当饲料摄入的能量跟不上产奶的消耗时，奶牛的身体就会启动“应急方案”——大量动员体脂。这导致了血液中非酯化脂肪酸（NEFA）水平的急剧升高。如同超负荷的原料涌入肝脏这个核心加工厂，过量的NEFA不仅不能被完全处理，还会引发“脂毒性”，损害肝细胞，并点燃肝脏的炎症反应，形成恶性循环，进一步加剧酮病和肝脏损伤。因此，深入理解NEFA如何诱发肝脏炎症损伤，并寻找内源性的保护机制，对于保障奶牛健康、提高牧场效益至关重要。
发表在《Journal of Dairy Science》上的一项研究，正是瞄准了这一关键问题。研究人员关注到一个名为神经前体细胞表达发育下调蛋白4（NEDD4）的分子。它是一种E3泛素连接酶，在调控抗炎过程中扮演重要角色，但其在酮病奶牛肝脏损伤中的作用尚不明确。研究团队假设，NEDD4可能通过调节一个关键的炎症和细胞死亡调控蛋白——受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的稳定性，来保护肝脏免受NEFA的攻击。为了验证这一猜想，他们开展了一系列严谨的实验。
在技术方法上，研究者首先从10头健康奶牛和10头临床酮病奶牛（产后3-9天）体内采集了肝脏活检组织和血液样本，进行体内分析。体外研究则使用从健康一日龄犊牛分离的原代牛肝细胞作为模型。主要关键技术包括：使用不同浓度NEFA（0, 0.6, 1.2, 2.4 mM）处理细胞以模拟酮病状态；通过腺病毒介导的基因过表达（Ad-NEDD4）和小干扰RNA（Si-NEDD4）技术分别上调和敲低NEDD4的表达；利用氯喹（CQ）和MG132分别抑制溶酶体和蛋白酶体通路以研究蛋白降解途径；通过分子克隆在293T细胞中共表达HA标签的NEDD4（HA-NEDD4）和Flag标签的牛RIPK1（Flag-RIPK1）质粒；以及蛋白质印迹（WB）、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光、实时定量PCR（qRT-PCR）、碘化丙啶（PI）染色和酶联免疫吸附测定等多种分子生物学技术来检测蛋白表达、相互作用、细胞死亡和炎症因子水平。
研究结果层层递进，揭示了NEDD4的保护性作用及其具体机制：
NEDD4 Expression Was Downregulated in the Liver of Ketotic Dairy Cows Accompanied by Inflammatory Damage
与健康奶牛相比，酮病奶牛血清中β-羟丁酸（BHB）、NEFA、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）浓度显著升高，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性也更高，表明存在系统性炎症和肝损伤。肝脏组织学分析显示明显的炎性细胞浸润和坏死区域。更重要的是，酮病奶牛肝脏中白细胞介素-1β（IL-1β）蛋白水平、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）与总NF-κB的比值以及磷酸化RIPK1（p-RIPK1）与总RIPK1的比值均显著升高，而NEDD4的蛋白表达则显著下调。这些结果表明，在酮病状态下，肝脏发生了炎症损伤，且NEDD4的表达受到抑制。
NEDD4 Expression Was Downregulated in NEFA-Treated Bovine Primary Hepatocytes with Inflammatory Damage
体外实验证实了NEFA的直接致病作用。用浓度递增的NEFA处理原代牛肝细胞，发现NEFA能以剂量依赖的方式降低NEDD4的蛋白和mRNA水平。同时，NEFA处理增加了PI阳性的坏死细胞比例，提升了培养上清中TNF-α和HMGB1的浓度，并上调了肝细胞内IL-1β、p-RIPK1的蛋白水平以及p-NF-κB/NF-κB的比值。这完美模拟了体内观察到的NEFA诱导的炎症损伤模型。
Effects of NEDD4 Overexpression on NEFA-Induced Inflammatory Damage in Bovine Hepatocytes
为了探究NEDD4的功能，研究人员过表达了NEDD4。结果显示，过表达NEDD4能够有效缓解1.2 mM NEFA引起的一系列有害效应：它减少了坏死细胞数量，降低了培养上清中TNF-α和HMGB1的浓度，并抑制了NEFA诱导的p-RIPK1、IL-1β蛋白上调和p-NF-κB/NF-κB比值的升高。这表明增强NEDD4的表达具有保护作用。
Effects of NEDD4 Knockdown on NEFA-Induced Inflammatory Damage in Bovine Hepatocytes
相反，当使用RNA干扰技术敲低NEDD4的表达后，情况恶化了。NEDD4敲低加剧了NEFA诱导的肝细胞坏死、炎症因子释放以及p-RIPK1、IL-1β蛋白水平和p-NF-κB/NF-κB比值的升高。这从反面证实了NEDD4在对抗NEFA损伤中的必要性。
Identification of RIPK1 as a Functional Ubiquitination Substrate of NEDD4
最后，研究深入到了机制层面。通过生物信息学预测和免疫荧光实验，发现NEDD4与RIPK1在肝细胞内存在相互作用。关键的机制实验表明：NEDD4过表达可以降低RIPK1的蛋白水平，而蛋白酶体抑制剂MG132（而非溶酶体抑制剂氯喹）能够阻断这一过程，说明NEDD4是通过蛋白酶体途径促进RIPK1降解。进一步的泛素化实验和双向免疫共沉淀实验证实，NEDD4确实能与RIPK1结合，并增强RIPK1的多聚泛素化修饰。这些发现确定了RIPK1是NEDD4的一个功能性泛素化底物。
归纳研究的结论与讨论部分，本研究的核心发现是：在酮病奶牛中，升高的NEFA会导致肝脏NEDD4表达下调。NEDD4作为一种保护性E3泛素连接酶，能够与RIPK1相互作用，通过泛素-蛋白酶体途径促进其降解。这一过程抑制了RIPK1的磷酸化（激活），进而阻断了下游NF-κB炎症信号通路的过度活化，最终减轻了NEFA诱导的肝细胞炎症损伤和坏死。简言之，NEDD4通过泛素化降解RIPK1来保护牛肝细胞免受NEFA诱导的炎症损伤。
这一发现具有多重重要意义。首先，它在分子水平上深化了对奶牛酮病并发肝脏损伤机制的理解，将NEDD4-RIPK1轴确立为一个关键的调控节点。其次，它揭示了泛素化修饰在代谢性疾病相关炎症中的重要作用。从转化医学的角度看，NEDD4作为一个可调控的靶点，为未来开发缓解或治疗奶牛酮病及其肝脏并发症的新型策略（例如寻找NEDD4激活剂）提供了坚实的理论依据和潜在方向。尽管研究存在一定局限，例如使用的犊牛肝细胞与成年泌乳奶牛肝细胞可能存在功能差异，但其所揭示的核心机制为保障奶牛健康、提升畜牧业生产效益带来了新的希望。
