蛋白质基纳米载体递送卡托基因衍生物至软骨基质用于骨关节炎的关节内治疗

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Protein-based nanocarrier delivering kartogenin derivative to cartilage matrix for intra-articular treatment of osteoarthritis

针对骨关节炎(OA)缺乏有效的关节内疾病修饰药物(DMOADs)及软骨靶向性差的难题，研究人员合成了一种阳离子亲和素-生物素-PEG2-卡托基因(Av-bKGN)纳米载体。该载体利用静电相互作用实现了对软骨基质的显著增强摄取与滞留，并通过单次给药达到了与多次游离药物给药相当的软骨保护效果，为骨关节炎的靶向治疗提供了新策略。

　　

膝关节疼痛、僵硬、活动受限——随着人口老龄化的加剧，骨关节炎（Osteoarthritis, OA）正困扰着全球数亿患者。作为最常见的退行性关节疾病，它无情地侵蚀着关节软骨，导致患者生活质量严重下降。然而，对抗这种疾病的武器库却显得捉襟见肘。目前临床上主流的治疗手段，如非甾体抗炎药和关节腔内注射透明质酸，大多只能暂时缓解症状，无法阻止或逆转软骨的进行性破坏，更谈不上“治愈”。人们迫切期盼着一种能够“治本”的药物出现，即疾病修饰性骨关节炎药物（Disease-Modifying Osteoarthritic Drugs, DMOADs）。

DMOADs的研发之路充满荆棘，至今尚无一款成功通过监管机构的严格临床试验。失败的原因复杂，但核心瓶颈之一在于“递送”难题。关节腔像一个充满滑液的封闭空间，直接注射药物似乎是理想途径。但现实是，游离药物在关节腔内滞留时间短，容易被快速清除；更重要的是，关节软骨本身结构致密，带负电荷，如同一道“静电屏障”，将许多大分子或中性药物拒之门外。软骨细胞——这些负责合成和维持软骨健康的“工程师”——深埋于软骨基质的深处。药物若无法穿透软骨全层、抵达细胞，再好的疗效也只是纸上谈兵。因此，开发一种能够精准靶向、高效穿透并长期滞留于软骨的递送系统，成为DMOADs研发成功的关键。

卡托基因（Kartogenin, KGN）就是这样一种备受瞩目的候选DMOAD。它于2012年被发现，能够以极低的浓度（100 nM）促进人间充质干细胞向软骨细胞分化，并在动物模型中展现出软骨保护作用。然而，KGN自身水溶性差，关节内注射后留存时间短，同样面临递送困境。以往的解决方案，如将其制成纳米晶体或包裹在聚合物微粒中，虽然改善了溶解度和留存时间，却往往因为尺寸过大（超过10 nm）而无法有效穿透健康的软骨基质。

那么，理想的“快递员”应该是什么样子？瑞士日内瓦大学（University of Geneva）药学院的Luca Morici、Olivier Jordan等研究团队将目光投向了一种天然蛋白质——亲和素（Avidin）。亲和素带有强正电荷，其尺寸微小（约7 nm），能够与软骨中带负电的糖胺聚糖（Glycosaminoglycans, GAGs）发生强静电吸引。前期研究已证实，基于亲和素的纳米载体能够有效穿透软骨并在其中滞留。本研究的核心创新在于，他们将KGN进行生物素化（Biotinylation）改造，通过强大的生物素-亲和素相互作用，将药物分子“挂载”到亲和素这个天然的软骨靶向“导航系统”上，构建出了一种全新的蛋白质基纳米药物——亲和素-生物素-PEG₂-卡托基因（Av-bKGN）偶联物，并系统评估了其治疗骨关节炎的潜力。这项研究成果发表在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》上。

为开展此项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，通过两步法化学合成了生物素-PEG₂-卡托基因（bKGN）衍生物，并利用核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）进行结构确认。其次，通过动态光散射（DLS）和ζ电位测量对Av-bKGN的粒径、电荷等理化性质进行表征。利用HABA（2-(4\’-羟基偶氮苯)苯甲酸）实验验证了四聚体结构的形成。第三，使用超高效液相色谱（UHPLC）在模拟滑液（SF）、生理盐水（PBS）及酯酶富集介质中进行了药物稳定性与代谢研究。第四，通过体外细胞实验（WST-1、LDH、Griess、IL-6免疫测定）评估了纳米载体的细胞毒性和抗炎活性。第五，利用来自牛膝关节的软骨外植体进行了一系列离体实验：通过荧光定量测定了纳米载体在软骨中的摄取率（R_u）和10天内的滞留情况；使用定制的扩散腔室实时测量了纳米载体在软骨中的一维扩散行为和有效扩散系数（D_eff）。最后，在IL-1α（白细胞介素-1α）刺激的离体OA模型中，通过二甲基亚甲基蓝（DMMB）法量化糖胺聚糖（GAGs）的损失，评估了纳米载体的软骨保护功效。

研究结果

3.1. bKGN的两步合成

研究人员成功开发了一种快速、可放大的两步合成法来制备bKGN，中间产物和最终产物的产率分别为88%和34%。¹H-NMR、¹³C-NMR和HRMS光谱证实了产物的正确结构。

3.2. Av-bKGN的制备及其理化性质表征

HABA实验证实，当bKGN与亲和素-HABA复合物的摩尔比达到4:1时，bKGN完全取代HABA，形成了四聚体Av-bKGN偶联物。动态光散射测量显示，Av-bKGN在生理介质中的流体动力学尺寸为8.7 ± 0.26 nm，与通过斯托克斯-爱因斯坦方程估算的理论尺寸（7.2 nm）接近。在PBS中，Av-bKGN的ζ电位为+18.3 ± 0.75 mV，与游离亲和素（+17.6 ± 3.37 mV）相近，显示出强正电性。然而，在模拟滑液中，所有样品（bKGN、Av-bKGN和Av）的ζ电位均变为负值（分别为-31.8 ± 1.32 mV、-36.1 ± 0.80 mV和-20.7 ± 4.13 mV），这可能是由于滑液中的白蛋白、透明质酸等成分在纳米颗粒表面形成了“生物冠”（biocorona）。非对称流场流分离（AF4）分析进一步证实了亲和素与白蛋白之间存在相互作用。

3.3. 在滑液、PBS和酯酶富集介质中卡托基因异吲哚啉衍生物的鉴定

稳定性研究表明，Av-bKGN在PBS和模拟滑液中24小时后仍能保持超过80%的稳定性。但在这些介质中，以及特别是在猪肝酯酶（PLE）富集的介质中，检测到了一种新的降解产物，被鉴定为异吲哚啉衍生物（ISO）。在含有1U和100U PLE的介质中，ISO的生成量分别增加至40%和60%，而KGN本身未被检测到，推测KGN可能快速且完全地环化形成了ISO。这是首次发现ISO作为KGN的新代谢产物。

3.4. 体外研究

3.4.1. 细胞毒性实验

WST-1实验表明，浓度高达10 μM的Av-bKGN对人间充质干细胞和软骨细胞的线粒体活性影响很小（活性保持80%以上）。在20 μM时，活性有所下降，但乳酸脱氢酶（LDH）释放实验未检测到显著的细胞膜损伤，表明在该浓度下细胞并未死亡。

3.4.2. Av-bKGN在体外减少炎症介质

在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中，Av-bKGN和ISO均能显著降低一氧化氮代谢物亚硝酸盐（NO₂^-）的产量，其抑制效果与阳性对照iNOS（一氧化氮合酶）抑制剂相当。在IL-1β（白细胞介素-1β）刺激的人软骨细胞中，1 μM的Av-bKGN处理能将炎症因子IL-6的释放量降低25%。这些结果表明Av-bKGN及其降解产物ISO具有一定的抗炎活性。

3.5. 离体实验

3.5.1. Av-bKGN在牛软骨外植体中的摄取和滞留增强

在PBS中，阳性的Av-b5/bKGN（用荧光标记的类似物）在软骨中的摄取率（R_u）约为14，是其中性对应物Ne-b5/bKGN（摄取率约3）的4.3倍，是游离染料的2.8倍。在模拟滑液中，所有化合物的软骨摄取均有所下降，但Av-b5/bKGN的摄取率（约8）仍然是Ne-b5/bKGN（约0.7）的11.4倍，凸显了静电相互作用的优势。在10天的滞留实验中，Av-b5/bKGN在PBS中保留了约40%的量，是中性对应物和游离染料（均约20%）的2倍。在模拟滑液中也观察到类似的增强滞留趋势。这表明Av-bKGN能够在软骨内形成药物储库。

3.5.2. 静电相互作用减缓了Av在软骨基质中的扩散

使用扩散腔室进行的实时一维扩散测量显示，Av-b5在软骨中的有效扩散系数（D_eff）约为8 x 10^-9cm²/s，比中性对应物Ne-b5和游离染料b5慢1000-4000倍。当载有药物bKGN时（Av-b5/bKGN），其D_eff值基本保持不变，表明药物偶联对运输性能影响不大。这直接证明了阳性的Av纳米载体与带负电的软骨基质之间存在强烈的静电结合，显著减慢了其扩散速度，从而有利于其在软骨内的驻留。

3.5.3. Av-bKGN确保软骨基质的软骨保护作用

在IL-1α刺激的牛软骨外植体OA模型中，评估了Av-bKGN的软骨保护功效。连续给予Av-bKGN能更有效地抑制GAGs的损失，效果优于连续给予游离bKGN。最为关键的发现是，单次给予Av-bKGN（10 μM）所能达到的GAGs保护效果（减少约16%的损失），与连续多次给予游离bKGN的效果相当。而单次给予游离bKGN则几乎无效，其GAGs损失水平与仅用IL-1α处理的组相似（超过20%）。这强有力地证明了Av作为递送平台，通过增强软骨靶向和滞留，能够实现“一次注射，长效缓释”的治疗效果。

结论与讨论

本研究成功构建并验证了一种基于静电相互作用的蛋白质纳米递送系统——Av-bKGN，用于骨关节炎的靶向治疗。其核心结论和重要意义在于：

首先，研究证实了尺寸与电荷是软骨靶向递送的关键。Av-bKGN凭借其纳米级尺寸（<10 nm）和强正电荷（+18.3 mV），能够高效穿透致密的软骨基质，并通过与带负电的GAGs的静电吸引，实现摄取量提升4.3-11.4倍、滞留时间延长2倍的显著效果。扩散实验直接观测到其扩散速度比中性载体慢数千倍，为静电滞留机制提供了直观证据。

其次，研究揭示了滑液复杂环境对递送的影响及系统的适应性。尽管模拟滑液中的蛋白质等成分会在Av-bKGN表面形成生物冠，使其整体电荷转为负值，并降低了部分摄取效率，但Av-bKGN的软骨靶向优势依然存在，其摄取和滞留仍显著优于中性载体。这表明除了静电作用，可能还存在其他如疏水相互作用等机制，共同介导了载体在真实关节环境下的软骨亲和。

第三，研究取得了重要的治疗学验证。离体OA模型实验证明，单次剂量的Av-bKGN所能提供的软骨保护（减少GAGs损失）等同于多次剂量的游离药物。这初步实现了将KGN从需要频繁注射的“短效药”转变为可能具有长效作用的“储库型制剂”的目标，为减少患者注射频率、提高治疗依从性和疗效带来了希望。

第四，研究有一个意外且重要的发现——首次在模拟关节炎（酯酶富集）环境中鉴定出KGN的一种新的降解代谢产物ISO，并发现其在体外具有一氧化氮抑制活性。这为理解KGN在体内的代谢命运和潜在活性代谢物打开了新窗口，未来需要进一步研究ISO是否具有与KGN类似的疾病修饰活性。

当然，研究也存在局限性，例如当前Av-bKGN系统的载药量有限（10 μM），在高浓度IL-1α刺激下未能将GAGs损失完全抑制到正常水平。作者指出，采用多臂（multi-arm）的亲和素纳米结构可以大幅提高载药量（可达100 μM），是未来优化的方向。此外，基于亲和素的载体潜在的免疫原性也需要在后续的临床前动物模型中进行仔细评估。

总而言之，这项研究巧妙地将天然的软骨靶向蛋白（亲和素）与有前景的DMOAD（卡托基因）相结合，为解决骨关节炎治疗中“药物到不了该去的地方”这一核心难题提供了一种创新且有效的递送策略。它不仅展示了静电靶向递送在治疗退行性组织疾病中的巨大潜力，其关于药物代谢的新发现也为该领域带来了新的科学见解，为开发下一代长效、靶向的骨关节炎疗法奠定了坚实的基础。