《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Manufacturing and testing of a polymer formulation for long-time release delivery of antisense oligonucleotides in hiPSC-derived motoneurons
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针对脊髓性肌萎缩症（SMA）等神经系统疾病，反复鞘内注射反义寡核苷酸（ASO）疗法存在侵入性强、副作用多等局限。为解决这一问题，研究人员设计并开发了基于乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）和EVA-二氧化硅复合材料的长效ASO缓释植入物。研究使用人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的SMA患者与对照来源的运动神经元模型，证明了该植入系统具有生物相容性，并能实现ASO的持续释放，有效促进SMN2基因外显子7（exon 7）的纳入，提高运动神经元存活率。这项工作为开发微创、长期的ASO中枢神经系统递送系统提供了重要的可行性依据。
对于患有脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）的婴幼儿来说，一种名为Nusinersen（商品名Spinraza?）的药物是生命的希望。它是一种反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO），能够精准地修复患者体内一个有缺陷的基因（SMN2），促使它产生足够的功能性SMN蛋白，从而挽救至关重要的运动神经元。然而，这份希望伴随着巨大的痛苦与风险：患者必须通过反复的腰椎穿刺（鞘内注射）来接受药物，最初密集时每隔几天就要进行一次，之后也需要每四个月注射一次。这个过程不仅侵入性强、可能带来感染等副作用，对于需要终身治疗的SMA患者而言，也是一个沉重而持续的负担。
有没有一种方法，能让药物在体内“细水长流”，一次植入就能缓慢释放数月甚至更久，从而大大减少注射次数呢？这正是发表在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》上的一项研究所追求的目标。来自德国神经退行性疾病中心（DZNE）的Maria Victoria Martinez-Dominguez、Lisa Falke等研究人员，将目光投向了长效药物递送系统的开发。他们设想制造一种微小的植入物，就像一个小小的“药物仓库”，能持续稳定地向中枢神经系统释放ASO药物。为了验证这个设想，他们选择了临床上已广泛使用的生物材料——乙烯-醋酸乙烯酯（Ethylene-Vinyl Acetate, EVA），并创造性地加入了介孔二氧化硅作为药物载体，构建了两种植入物配方：纯EVA，以及EVA与二氧化硅的复合材料（EVA-二氧化硅）。他们的核心问题是：这种植入物能安全、均匀地承载ASO吗？它能否实现长效、可控的药物释放？更重要的是，释放出的药物能被细胞有效摄取，并发挥应有的治疗作用吗？
为了回答这些问题，研究团队巧妙地建立了一个高度相关的体外“替身”模型。他们从SMA患者（包括不同严重程度的I型、II型、III型）和健康对照者的皮肤细胞出发，通过重编程技术获得了人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs），再将这些hiPSCs定向分化为疾病的核心受累细胞——运动神经元。这就好比在培养皿里“复刻”了患者的疾病细胞，为后续测试药物的效果和安全性提供了一个绝佳的平台。
研究采用了多项关键技术方法：首先，利用真空压缩成型技术制造了两种含有荧光标记ASO的植入物。其次，通过高效液相色谱验证了ASO在长期释放环境下的稳定性。再者，使用激光共聚焦显微镜观察了植入物中药物的分布以及运动神经元对ASO的摄取情况。此外，通过RT-PCR检测了SMN2基因外显子7的纳入率，并通过免疫荧光染色量化了SMN蛋白水平，以此评估药物的功能疗效。最后，采用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性测定评估了植入物与细胞共培养的生物相容性。整个研究围绕从患者来源的hiPSC分化的运动神经元模型展开，系统地评估了植入物的制备、释放、细胞作用及功能效果。
研究结果
植入物的制备与药物分布
研究人员成功使用微尺度真空压缩成型技术制备了EVA和EVA-二氧化硅植入物。关键发现是，当ASO先加载到二氧化硅颗粒中，再分散到EVA基质里时，荧光标记的ASO分布比直接混入纯EVA中更为均匀和广泛。这为解决ASO在疏水性聚合物中分布不均的难题提供了一种有效策略。
运动神经元模型的成功建立与表征
从hiPSC成功分化出了高纯度的运动神经元。在所有基因型（对照及SMA各型）的培养物中，神经元标志物MAP2阳性细胞占比达55-70%，而其中表达运动神经元特异性标志物胆碱乙酰转移酶（ChAT）的细胞高达90-95%，证实了稳健的分化效率，为后续药效研究奠定了基础。
ASO的摄取、稳定性与最佳剂量确定
研究发现，hiPSC来源的运动神经元能通过“自由摄取”机制有效内化ASO。ASO在模拟体液环境中（37°C PBS）可稳定存在至少5个月。剂量-反应实验确定了能显著提高SMN2外显子7纳入率的ASO最低有效浓度：对于II型和III型SMA运动神经元，浓度为300 nM即可见效；而对于更严重的I型，则需要≥600 nM。一次600 nM的ASO处理能在6天内将外显子7纳入率提升至最高水平。
植入物的生物相容性
将EVA和EVA-二氧化硅植入物与运动神经元共培养28天，通过LDH细胞毒性检测发现，与未处理组相比，植入物并未引起细胞毒性指标的显著升高，初步证明了这两种材料在体外具有良好的生物相容性。
ASO的释放动力学
长达28天的释放实验揭示了两种植入物不同的释放特征。纯EVA植入物释放缓慢而平稳，28天内累计释放了约20%的ASO。而EVA-二氧化硅植入物的释放更快且总量更高，同期累计释放达到约55%，且在实验后期更换新鲜培养基后，释放还能持续。重要的是，两者均未观察到明显的“突释”现象，呈现出一种受扩散控制的缓释模式。
持续释放ASO的功能效应
这是研究最核心的发现。与一次性给予600 nM ASO（单次注射模拟）相比，与EVA或EVA-二氧化硅植入物共培养的运动神经元，其SMN2外显子7的纳入率得到了更持久的提升。单次给药的效应在培养后期（第48天）已消失，而两种植入物在培养第34天和第48天时，仍能显著提高纳入率。EVA-二氧化硅植入物甚至在培养一周后（第27天）就显示出显著效果。进一步实验证明，这种持续的效果并非单纯由累积剂量导致，因为将植入物在各时间点释放出的ASO浓度作为单次剂量给药，均无法复制出相同的疗效提升。这突显了持续、低浓度的药物暴露对于维持ASO的长期药效至关重要。
对运动神经元存活的影响
在培养后期（第38天和45天），与ASO植入物共培养或接受过单次ASO处理的运动神经元，表现出更低的细胞毒性（LDH释放减少）。同时，细胞死亡相关标志物p53的mRNA水平在ASO处理组中也呈下降趋势，尤其在EVA处理组第34天时下降显著。这表明ASO治疗可能对运动神经元的存活有积极影响。
结论与讨论
这项研究为开发一种用于中枢神经系统的微创、长效ASO递送植入物迈出了重要的第一步。它系统地解决了从制剂生产（实现ASO在聚合物中的均匀分布）、药物释放（获得无突释的缓释曲线）、到生物效应验证（在患者来源的疾病模型上证实疗效）等多个关键环节的可行性。
讨论部分深入分析了本研究的发现与意义。首先，研究选择了非生物降解的EVA而非常用的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，这避免了PLGA降解产生的酸性环境对ASO稳定性的潜在威胁，并能提供更可预测的扩散控释。其次，二氧化硅的加入不仅改善了药物分布，还意外地提高了药物的释放速率和总量，其机制可能是改变了聚合物基质的内部微观结构，为ASO提供了更多扩散通道。最重要的是，研究从药理学角度论证了这种缓释策略的优势：相比于传统鞘内注射产生的高峰值浓度和快速衰减，植入物提供的持续、低浓度暴露能更持久地维持细胞内靶点结合，在降低潜在峰值相关毒性的同时，实现更持久的治疗效果。这一点在功能实验中得到完美印证——持续释放的效果远超等效浓度的单次冲击。
当然，研究也存在局限，例如这完全是一项体外研究，体内复杂的脑脊液动力学和组织反应可能改变释放行为；EVA不可降解，未来临床转化需考虑手术更换问题。然而，考虑到SMA患者需要终身治疗，每年一次或更少频率的微创植入手术替换，其负担远低于当前每年四次的反复腰椎穿刺。
总之，这项工作成功地将制剂工程与疾病生物学模型相结合，不仅为改善SMA的现有疗法提供了极具潜力的新思路，也为其他需要ASO治疗的神经系统疾病（如其他神经退行性疾病）的长效给药平台开发奠定了坚实的基础。它证明了通过合理的材料选择和剂型设计，实现ASO在CNS的长效、稳定、功能性的递送是可行的，为后续的优化和临床前开发铺平了道路。
