《Journal of Ethnopharmacology》：Zingiber zerumbet rhizome attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis by regulating TGF-β1 and TNF/NF-κB signaling to inhibit epithelial-mesenchymal transition and fibroblast activation
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当前针对肺纤维化的临床治疗药物有限且效果不佳。本研究探索传统草药红花月桃根茎提取物作为多靶点植物疗法的潜力。研究人员发现，该提取物在细胞和动物模型中，通过调控TGF-β1与TNF/NF-κB信号通路，能有效抑制上皮-间质转化(EMT)、成纤维细胞活化，并减少胶原沉积和氧化应激，展现出显著的抗纤维化活性，为开发新型肺纤维化治疗药物提供了新思路。
肺，这个掌管生命呼吸的精密器官，其基本功能单位——肺泡的结构一旦被破坏，便会引发一系列严重的疾病。肺纤维化正是这样一种疾病，它以肺泡上皮细胞的持续损伤为起点，进而导致异常的修复反应、过度炎症和细胞外基质（富含成纤维细胞和胶原蛋白）的异常积聚。这就像一个房间原本通透的墙壁被水泥糊死，气体交换功能严重受损。特发性肺纤维化患者的预后尤其严峻，诊断后平均生存期仅为三到五年。
目前，临床上用于治疗肺纤维化的药物仅有尼达尼布和吡非尼酮两种。它们虽能延缓功能衰退并提供有限的症状缓解，但无法阻止疾病的持续进展。肺移植虽是能延长生存期的干预手段，却因供体稀缺和患者合并症等问题，只适用于极少数患者。这些现状凸显了对新型、有效且能改变疾病进程的治疗方案的迫切需求。在此背景下，天然产物因其多靶点、多途径调节复杂疾病的潜力而备受关注。
红花月桃，一种在亚洲传统医学中常用于治疗呼吸道疾病的药用植物，走进了研究人员的视野。其根茎在民间长期用于治疗咳嗽、哮喘等病症，其富含的生物活性倍半萜（尤其是其主要成分姜花酮）已被证明具有抗炎、抗氧化和抗纤维化潜力。此前的一项计算研究预测，红花月桃可能通过作用于表皮生长因子受体（EGFR）、TGF-β1、基质金属蛋白酶（MMPs）和TNF-α等关键分子靶点，调控包括TGF-β1和TNF-α信号在内的核心通路。基于这些背景，来自印度马尼帕尔高等教育学院的一支研究团队，在《Journal of Ethnopharmacology》上发表了一项研究，旨在评估红花月桃根茎乙醇提取物的抗纤维化效果，并在细胞和动物模型中阐明其调节上皮-间质转化（EMT）、成纤维细胞增殖和炎症信号的具体机制。
主要技术方法
本研究综合运用了体外细胞实验和体内动物模型。首先，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析了提取物的化学成分。在细胞层面，使用转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激人肺泡上皮细胞（A549）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3），分别模拟EMT和成纤维细胞活化，通过划痕愈合实验、免疫荧光（检测E-钙黏蛋白）和蛋白质印迹法评估提取物的影响。在动物层面，建立了大鼠博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化模型，通过跑步机耐力测试、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数、肺组织病理学染色（H&E和Masson三色染色）、蛋白质印迹以及脂质过氧化（硫代巴比妥酸反应物法测定丙二醛水平）等多项指标，全面评估提取物的治疗效果。
研究结果
3.1. LC-MS/MS分析红花月桃成分
分析鉴定出提取物中含有30种生物活性化合物，包括姜花酮、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、4-O-乙酰阿福豆苷等关键成分。
3.2. 对A549和NIH3T3细胞的细胞毒性测定
确定了提取物对A549和NIH3T3细胞的半抑制浓度（IC50）值，分别为462.8±29.51 μg/ml和243.43±30.08 μg/ml，为后续实验选择了亚毒性浓度。
3.3. 红花月桃抑制成纤维细胞增殖和分化
划痕愈合实验表明，在TGF-β1刺激下，NIH3T3细胞的迁移率高达98.46±2.41%。红花月桃提取物（110 μg/ml）和尼达尼布（4 μg/ml）处理显著抑制了这种迁移，分别将其降低至17.03±1.35%和3.15±1.90%，表明提取物能有效抑制成纤维细胞的增殖和分化。
3.4. 红花月桃抑制TGF-β1刺激的A549细胞间质转化
免疫荧光显示，TGF-β1刺激导致上皮标记物E-钙黏蛋白表达显著下调，诱导了EMT。而红花月桃提取物（200 μg/ml）和尼达尼布（30 μg/ml）处理能显著恢复E-钙黏蛋白的表达水平，表明它们有效抑制了TGF-β1介导的EMT。
3.5. A549和NIH3T3细胞的蛋白质印迹分析
在A549和NIH3T3细胞中，红花月桃提取物处理显著下调了TNF-α下游标志物核因子κB（NF-κB）及其磷酸化（p-NF-κB）的表达。在A549细胞中，提取物还下调了EGFR（表皮生长因子受体）的表达；在NIH3T3细胞中，提取物下调了血小板衍生生长因子B（PDGFB）的表达。这表明提取物能调控TNF/NF-κB信号通路，并影响与纤维化相关的关键蛋白。
3.6. 第14天肺纤维化模型的确认
博来霉素诱导的大鼠在第14天表现出运动耐力显著下降、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞百分比升高，以及肉眼可见的肺组织变硬、颜色变深等纤维化特征，成功确认了肺纤维化模型的建立。
3.7. 脂质过氧化测定
与正常对照组相比，疾病对照组大鼠肺组织中的丙二醛（MDA）水平显著升高，表明氧化应激增强。而经过尼达尼布和红花月桃提取物（200 mg/kg和600 mg/kg）治疗后，MDA水平均有所降低，提示提取物具有抗氧化作用。
3.8. 蛋白质印迹分析评估通路和纤维化标志物（大鼠模型）
在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织中，关键的纤维化生长因子TGF-β1和促炎细胞因子TNF-α的表达均显著上调。红花月桃提取物治疗能剂量依赖性地显著降低这两种蛋白的表达。同时，提取物还能显著抑制NF-κB的磷酸化（p-NF-κB），但不影响其总蛋白水平，表明其能特异性调控该炎症信号通路的活性。
3.9. 组织病理学分析和阿什克罗夫特评分
3.9.1. 苏木精-伊红（H&E）染色
疾病对照组肺组织显示肺泡上皮增生、中性粒细胞浸润、肺泡腔形状不规则、肺泡间隔增厚等严重病理改变。尼达尼布和红花月桃提取物治疗组，特别是高剂量（600 mg/kg）组，这些病变得到明显改善，肺泡结构保存较好，炎症细胞浸润减少。阿什克罗夫特评分量化显示，提取物治疗能显著降低纤维化评分。
3.9.2. 马松三色（Masson trichrome）染色
该染色特异性地显示胶原（蓝色）。疾病对照组肺组织中出现广泛的间质、支气管周围和血管周围胶原沉积，形成致密的纤维化病灶。治疗组，尤其是高剂量红花月桃组，胶原沉积显著减少，肺组织结构得到更好保护。
研究结论与重要意义
本项研究通过细胞和动物模型证实，红花月桃根茎提取物对肺纤维化具有显著的防护和治疗作用。其核心机制在于多靶点调控：一方面，通过调控TGF-β1信号通路，维持上皮细胞表型，抑制上皮-间质转化（EMT）；另一方面，通过抑制TNF/NF-κB信号轴，减少成纤维细胞的迁移、活化和向肌成纤维细胞转化（FMT）。这两种关键的生物学过程的调控，共同有助于维持肺泡稳态。
在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，红花月桃治疗有效地保留了肺泡空间和较薄的肺泡间隔，改善了整体肺组织结构，并显著限制了胶原沉积。这些发现验证了早期网络药理学对红花月桃作用机制的预测，凸显了该研究方法在识别生物活性成分和绘制纤维化中通路交叉对话方面的价值。
综上所述，红花月桃作为一种多靶点的植物疗法候选药物，在调控肺纤维化关键致病通路、抑制纤维化核心细胞事件方面展现出巨大潜力。这项研究不仅为深入理解这种传统草药的作用机制提供了实验依据，也为开发针对肺纤维化这种难治性疾病的新型治疗策略带来了希望。未来的研究可以进一步探索红花月桃在慢性纤维化模型中的效果、其药代动力学特性，并评估其与现有抗纤维化药物（如尼达尼布）的协同作用。
