《Advanced Science》：Super-Enhancer-Driven SOX4/SMAD3 Mediate Membrane Remodeling by Regulating Phospholipid Metabolism to Accelerate Leukemia Progression
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这篇研究论文揭示了慢性粒细胞白血病（CML）从慢性期（CP）进展至急变期（BP）的关键分子机制。研究发现，在CML-BP中，转录因子SOX4和SMAD3受超级增强子（SE）驱动，形成一个正反馈调节轴。该轴不仅直接激活受体酪氨酸激酶AXL的转录，还通过上调LPCAT1促进饱和磷脂（如DPPC）合成，从而改变细胞膜流动性，促进AXL的膜定位与激活。靶向此轴的AXL抑制剂Bemcentinib在体内外模型中均能有效抑制CML-BP进展。本研究为理解CML的急变转化提供了新的转录和代谢调控视角，并提示了潜在的治疗策略。
引言
慢性粒细胞白血病（CML）是一种由BCR-ABL融合癌基因驱动的造血干细胞克隆性疾病。其临床病程通常分为慢性期（CP）、加速期和急变期（BP）。尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）对CML-CP有效，但CML-BP仍然因治疗耐药和生存期短而面临巨大挑战。越来越多的证据表明，表观遗传调控元件的异常激活会重塑癌症的转录组，导致癌细胞对特定的转录调控因子产生依赖性。然而，特定的转录机制是否以及如何促进CML从慢性期向急变期转化，目前尚不清楚。
结果
2.1 整合分析鉴定出在CML-BP中具有相互调节作用的SE驱动转录因子SOX4和SMAD3
为了探究CML转化的机制，研究团队整合分析了CML患者样本的H3K27ac染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）数据。通过比较分析，鉴定出24个BP特异性的超级增强子（SEs），并将其注释到邻近基因。进一步筛选出四个在CML-BP中mRNA表达上调且受SE驱动的转录因子：SMAD3、SOX4、CXXC5和KLF9。其中，SOX4和SMAD3在CML-BP中呈现出强烈的正相关性，而在CML-CP和急性髓系白血病（AML）中则呈负相关。
在CML-BP细胞系中，敲低SOX4或SMAD3会降低另一因子的mRNA和蛋白表达水平，而过表达其中一个则会提升另一个的水平，这表明二者存在相互依赖的正向调控关系。利用BET抑制剂（ABBV-744, ARV-771）处理细胞，发现SOX4和SMAD3的表达呈剂量依赖性抑制，证实了它们对SE活性的依赖。此外，对SE区域的基序分析为SOX4和SMAD3之间的相互调控关系提供了直接证据。
2.2 SOX4/SMAD3互作调控轴的机制解析
为了阐明其共同调控机制，研究在CML-BP细胞中进行了针对SOX4和SMAD3的CUT&Tag分析，结果显示这两个转录因子共同占据彼此的增强子和启动子区域。染色质免疫沉淀再沉淀（ChIP-re-ChIP）实验进一步证实了SOX4和SMAD3在相同的DNA模板上共存。
研究鉴定了SOX4超级增强子内的一个启动子区（PR1）和两个候选增强子成分（CE1， CE2）。荧光素酶报告基因实验表明，PR1和CE2具有显著的报告基因活性，而CE1则没有。敲低SOX4或SMAD3会显著降低PR1和CE2的活性，而过表达则有相反效果。基序分析显示，在CE2区域内，SOX4和SMAD3的结合位点间距小于146个碱基对。免疫共沉淀结果也证实了SOX4和SMAD3之间存在蛋白质相互作用。
为了进一步验证CE2的功能，研究利用dCas9-KRAB系统靶向抑制该增强子区域，导致该位点的H3K27ac信号显著降低，SOX4和SMAD3的结合减少，进而下调了SOX4的mRNA和蛋白表达，同时也降低了互作因子SMAD3的表达。这最终损害了CML-BP细胞的增殖并促进了其红系和巨核系分化。染色体构象捕获（3C）实验证实，SOX4-CE2与SOX4启动子之间存在直接的染色体空间相互作用。
2.3 SOX4/SMAD3协同调控CML进展中的转录网络
为研究SOX4和SMAD3在CML转录组调控中的机制基础，研究分析了它们在CML细胞中的表观基因组占据特征。结果显示，SOX4和SMAD3在启动子和增强子区域的协同占据（双重结合）远多于单独占据。与单独结合区域相比，双重结合区域表现出更高的H3K27ac信号强度，并且更可能与超级增强子重叠。匹配的RNA-Seq数据分析表明，与双重结合的启动子或增强子相关的基因表达水平显著高于单独结合的基因，支持了SOX4和SMAD3的协同转录调控。
在约40%的同时含有SOX4和SMAD3基序的双重结合区域中，结合位点位于核小体跨度距离内。在细胞中敲低任一因子会全局性减少两个伙伴蛋白的结合，并伴有H3K27ac信号的减弱。RNA-seq和基因集富集分析（GSEA）显示，敲低SOX4后减少或增加的基因，在敲低SMAD3后也同样显著富集。这些共下调的基因在来自患者的“急变期”相关基因集中显著富集。这些发现确立了SOX4/SMAD3协同性是CML进展（特别是急变转化）中转录失调的一个机制特征。
2.4 敲低SOX4/SMAD3在体外损害CML进展
功能实验验证了CML-BP细胞的恶性转化依赖于SOX4和SMAD3的表达。在所有测试的CML-BP细胞系中，敲低SOX4或SMAD3均导致细胞增殖速率减慢，而过表达则增强了CML细胞的增殖能力。此外，SOX4/SMAD3敲低显著降低了细胞的克隆形成能力。在分化方面，敲低SOX4或SMAD3促进了LAMA-84细胞的巨核细胞分化（CD61标记）和红系分化（CD71标记），并增强了KBM5细胞在全反式维甲酸（ATRA）刺激下的粒细胞分化（CD11b标记）。而过表达SOX4/SMAD3则降低了K562细胞中巨核系和红系分化阳性细胞的比例。
当同时敲低SOX4和SMAD3时，对CML细胞增殖和分化能力的影响比单独敲低任一因子更显著。此外，过表达对应的转录因子可以部分恢复敲低后的表型，例如过表达SMAD3可以恢复敲低SOX4所导致的增殖能力下降和原始细胞转化能力减弱。总之，SOX4和SMAD3协同促进增殖、抑制分化，从而推动CML进展。
2.5 SOX4/SMAD3共同调控AXL通路驱动CML进展
通路富集分析发现，敲低SOX4或SMAD3后共下调的基因在“受体酪氨酸激酶信号传导”及其相关的“酶联受体信号传导”以及“脂质代谢”等通路中富集。考虑到BCR-ABL在CML中的核心作用，研究首先验证了其是否参与SOX4/SMAD3驱动的CML进展。结果表明，敲低SOX4/SMAD3并未改变BCR-ABL的mRNA或蛋白水平，提示SOX4/SMAD3可能调控了其他的酪氨酸激酶信号通路。
通过综合分析两个通路中受调控的受体表达变化，研究确定AXL是一个共同的下游受体。AXL最初在CML中被鉴定，且已有报道与CML的耐药性相关。CUT&Tag分析显示，SOX4/SMAD3主要结合在AXL的启动子和增强子元件上。敲低SOX4或SMAD3抑制了AXL的表达。功能上，敲低AXL损害了CML细胞的增殖并促进了其分化。同样，选择性AXL抑制剂Bemcentinib也能有效抑制CML细胞增殖并促进分化。
免疫印迹实验证实，无论是遗传学上敲低SOX4、SMAD3或AXL，还是药理学上使用Bemcentinib抑制AXL，均能降低CML细胞中STAT5、AKT和ERK的磷酸化水平。值得注意的是，AXL同样不调控BCR-ABL的表达或磷酸化，表明SOX4/SMAD3可能通过AXL介导的、不依赖BCR-ABL的致癌通路促进CML进展。利用SynergyFinder工具评估伊马替尼和Bemcentinib的协同效应，发现两种药物之间存在强协同作用。
过表达AXL可以挽救由敲低SOX4或SMAD3引起的生长缺陷，阻止细胞分化，并激活下游关键介导因子的磷酸化。AXL作为膜受体，其功能主要依赖于与配体GAS6的结合。研究证实敲低SOX4、SMAD3或AXL不影响内源性GAS6的表达。添加外源性GAS6仅能轻微挽救SOX4/SMAD3敲低细胞的增殖表型，但对AXL敲低细胞无效，这可能与AXL表达量极低有关。
令人意外的是，免疫荧光分析发现，敲低SOX4和SMAD3不仅降低了AXL的表达，还减少了其在细胞膜上的定位。对活细胞进行荧光漂白恢复（FRAP）实验表明，敲低SOX4/SMAD3导致了细胞膜流动性的增加。这些数据表明，SOX4/SMAD3协同促进AXL的转录，并通过调节细胞膜流动性来调控其膜定位，从而激活CML中的致癌信号级联反应。
2.6 SOX4/SMAD3通过调控饱和磷脂合成介导AXL定位与激活
通路分析提示SOX4/SMAD3调控脂质代谢。GSEA也显示脂质代谢基因集在CML-BP中显著富集，表明脂质代谢失调可能是急变期进展的一个潜在特征。深入分析“脂质代谢”富集基因，发现这些基因富集于磷脂代谢和特定的磷脂酰胆碱（PC）代谢通路中。磷脂（PL），特别是PC，是细胞膜的主要成分，其饱和度与膜的序性和流动性密切相关。
为了量化SOX4/SMAD3对脂质代谢的影响，研究对LAMA-84细胞进行了非靶向脂质组学分析。结果显示，敲低SOX4或SMAD3引起了磷脂谱的显著变化，表现为含有饱和脂肪酸（SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）的磷脂比例显著下降，而含有多不饱和脂肪酸（PUFA）的磷脂比例上升。
选择变化最明显的饱和磷脂DPPC（16:0/16:0）和单不饱和磷脂POPC（16:0/18:1）进行挽救实验。增殖实验表明，外源性添加DPPC能更显著地挽救由SOX4/SMAD3敲低引起的增殖缺陷。一致地，DPPC也能部分挽救分化表型。FRAP实验发现，外源性添加DPPC并将其掺入质膜后，能恢复SOX4和SMAD3敲低细胞中增加的膜流动性，从而恢复了AXL的膜定位和激活。这表明SOX4/SMAD3不仅直接调控AXL表达，还通过调节脂质代谢介导其分布。
2.7 SOX4/SMAD3通过调控LPCAT1介导质膜重塑
结合RNA-seq和CUT&Tag数据，研究聚焦于膜脂重塑的关键酶LPCAT1。SOX4和SMAD3直接结合在LPCAT1的启动子和增强子元件上。LPCAT1在CML-BP患者中表达上调。敲低SOX4或SMAD3抑制了LPCAT1的mRNA和蛋白表达。
为确认LPCAT1的作用，研究利用shRNA沉默其表达，其结果与敲低SOX4/SMAD3的表型一致：导致脂质含量（尤其是磷脂）发生变化，降低了膜磷脂的饱和程度，DPPC含量也大幅减少。LPCAT1的敲低改变了膜的序性和流动性，从而促进了AXL从质膜内化至细胞内区室。此外，LPCAT1敲低削弱了细胞增殖，促进了分化，并减少了AXL介导的下游信号激活。
为阐明LPCAT1介导的膜磷脂重塑作为SOX4/SMAD3下游介质的重要作用，研究尝试通过过表达LPCAT1 cDNA来挽救shSOX4或shSMAD3的增殖表型。结果表明，过表达LPCAT1确实恢复了膜流动性、增殖能力、AXL膜定位及其激活。此外，LPCAT1敲低表型可通过补充DPPC或过表达AXL得到部分恢复。最后，实验发现单独过表达AXL或LPCAT1，或单独补充DPPC，均不能完全逆转SOX4/SMAD3敲低导致的增殖缺陷，只有联合干预才能完全恢复表型，这表明SOX4/SMAD3通过双重调控机制（直接转录激活AXL和通过LPCAT1调节其膜定位）发挥作用。
2.8 靶向SOX4/SMAD3-AXL轴在体内抑制CML进展
为探究SOX4和SMAD3在CML进展中的体内作用，研究采用了两种成熟的小鼠模型：一种仅由BCR-ABL驱动（BA CML小鼠），另一种共表达BCR-ABL与NUP98-HOXA9（BA/NH CML小鼠）。无论何种遗传背景，敲低SOX4或SMAD3均能一致抑制疾病进展。具体表现为：外周血中GFP+白血病细胞和白细胞总数减少；受体小鼠骨髓中GFP+髓系白血病细胞的植入受到显著抑制，并伴有分化倾向；脾肿大严重程度减轻，白血病细胞浸润减弱。流式分选的GFP+白血病细胞显示，SOX4和SMAD3在体内存在mRNA和蛋白水平的相互调控，并对AXL和LPCAT1有调控作用。
非靶向脂质组学分析揭示，敲低SOX4/SMAD3诱导了BA CML小鼠体内显著的脂质失调，其特征是磷脂种类（特别是PC）发生显著改变。对磷脂饱和度的进一步分析表明，与人类CML-BP细胞系中的观察一致，敲低转录因子降低了SFA-PL和MUFA-PL的比例。机制上，对BA CML小鼠白血病细胞的CUT&Tag分析证实，SOX4和SMAD3在全基因组范围内主要共占据启动子和增强子区域，并且相互结合在彼此的启动子和增强子区域。此外，两个转录因子都直接结合在AXL和LPCAT1的调控元件上。重要的是，敲低SOX4或SMAD3显著延长了CML-BP小鼠的生存期，凸显了该轴在疾病维持中的功能必要性。
接下来，研究在两种CML小鼠模型中检验了AXL抑制剂Bemcentinib的体内效果。与预期一致，Bemcentinib治疗显著减少了外周血中的GFP+白血病细胞，降低了白细胞计数，减轻了骨髓中的白血病细胞负荷，促进了细胞分化，并缓解了脾脏的病理严重程度。免疫印迹结果显示，Bemcentinib显著阻断了白血病细胞中AXL的激活。此外，治疗耐受性良好，体重无显著变化，血清肝肾功能指标（ALT， AST， CR）与对照组相当。总之，药理学抑制AXL延缓了CML的进展，Bemcentinib代表了一种有前景的CML治疗策略。
讨论
由超级增强子介导的转录失调在其他癌症的发生发展中已被广泛研究，但在CML进展中鲜有报道。本研究通过对不同临床阶段CML患者样本进行H3K27ac ChIP-seq和RNA-seq，经过整合多组学分析和严格筛选，鉴定出4个候选转录因子。有趣的是，SOX4和SMAD3仅在CML-BP中表现出高度相关性，并进一步验证了它们通过共结合彼此的以及自身的增强子或启动子元件来相互调控转录。SOX4和SMAD3以小于150 bp的间距协同结合，并由核小体以及直接的蛋白质-蛋白质相互作用介导，增强了转录复合物的稳定性。
SOX4在急性白血病中作为癌基因发挥作用，而SMAD3作为TGF-β信号效应子，与FOXO3a协同调控转录，是CML干细胞维持所必需的。然而，SOX4和SMAD3在CML转化中的作用此前尚未见报道。
在本研究中，发现SOX4和SMAD3在体外和体内协同加速CML的恶性进展。为了阐明机制，研究在敲低每个转录因子后进行了RNA-seq通路富集分析。由于与CML生物学相关，优先研究了两个重叠的高排名通路（受体酪氨酸激酶信号传导和脂质代谢）。在“受体酪氨酸激酶信号传导”通路的候选基因中，发现SOX4和SMAD3通过结合其启动子和增强子直接调控AXL。研究表明，SOX4/SMAD3调控AXL的表达，从而激活其下游致癌信号通路，最终促进CML进展。值得注意的是，AXL抑制剂Bemcentinib在体外和体内均显著抑制CML细胞的增殖和进展。
受体酪氨酸激酶介导的信号通路受配体、受体及其下游效应物共定位于脂筏/小窝蛋白-1富集的膜微域调控。膜受体AXL的功能依赖于与其配体GAS6的结合。骨髓来源的基质细胞分泌的GAS6激活白血病细胞上的AXL，形成旁分泌调节环。因此，AXL的膜定位对于配体结合和信号通路激活至关重要。令人惊讶的是，研究发现敲低SOX4/SMAD3不仅降低了AXL的表达，还减少了其膜定位。膜受体的定位和信号活性受细胞膜生物物理特性的影响，包括曲率、电荷、序性、流动性和结构。
正如通路富集所提示的，SOX4/SMAD3调控脂质代谢，特别是PC代谢。PC通过Kennedy途径从头合成，然后通过Lands循环进行脱酰-再酰化重塑。Lands循环通过修饰脂肪酸饱和度和其他生化特征来有效地多样化膜磷脂。Lands循环的再酰化阶段由溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶LPCATs催化。研究证实，SOX4/SMAD3可以直接调控磷脂代谢的关键酶LPCAT1，从而改变膜中饱和磷脂的含量，重塑膜结构、序性和流动性。外源性过表达LPCAT1或补充其代谢产物DPPC（一种饱和PC），可以逆转AXL的内化并恢复其膜定位。然而，SOX4和SMAD3可能还调控LPCAT1以外的膜磷脂重塑通路，例如调控影响胆碱转运的SLC44A2，调控影响PC在内质网和质膜之间运输的STARD10和PCTP。这些局限性是未来需要突破和解决的方面。
结论
本研究鉴定了一个由SOX4/SMAD3协同驱动的特异性转录调控网络。具体而言，SOX4和SMAD3不仅直接调控AXL的表达，还通过调控LPCAT1介导的膜磷脂重塑来影响AXL的膜定位和激活，这两者在CML的进展中都扮演着重要角色。这些发现增强了我们对CML转化过程中转录失调的理解，并提供了潜在的治疗策略。
