《Advanced Science》：Anti-Apoptotic and Neurite-Protective Nanomedicine Augments Embryonic Stem Cells-Derived Retinal Ganglion Cell Transplantation in Glaucoma Recovery
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本研究发现锂-表没食子儿茶素没食子酸酯纳米颗粒 (Li-EGCG NPs) 能通过协同增强抗氧化能力和神经保护作用，改善青光眼恶劣微环境。该纳米药物在体外能减轻胚胎干细胞源性视网膜节细胞 (ESC-RGCs) 的氧化应激诱导凋亡，保护线粒体稳态和轴突完整性；在视网膜缺血/再灌注 (I/R) 损伤模型中，与 ESC-RGCs 联合治疗能显著提高移植细胞存活率、保护视网膜结构并恢复视觉功能，为视网膜神经退行性疾病的细胞治疗提供了有前景的纳米医学平台。
引言
青光眼是一种进行性神经退行性疾病，是全球不可逆性失明的主要原因之一，影响着超过8000万人。该疾病的特征在于视网膜节细胞 (RGCs) 及其轴突的逐渐丧失，导致不可逆的视野缺损和最终视力丧失。目前的临床干预措施，如降低眼内压 (IOP) 的药物和外科手术，可以延缓疾病进展，但一旦 RGCs 死亡就无法逆转损伤。因此，迫切需要能够通过保护或替换受损的RGCs来恢复视功能的有效治疗策略。
结果与讨论
1. Li-EGCG NPs 的设计、制备与表征
锂-表没食子儿茶素没食子酸酯纳米颗粒 (Li-EGCG NPs) 是通过在中性pH条件下将 Li+离子与 EGCG 配位，然后温和搅拌 24 小时合成的。透射电子显微镜 (TEM) 显示所得纳米颗粒具有均匀且轮廓分明的球形形态。动态光散射 (DLS) 测量显示 Li-EGCG NPs 的水合直径约为 460 nm。傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱分析表明，O-H 伸缩振动峰从 3364 cm?1移至 3342 cm?1，而 C=O 伸缩带从 1606 cm?1移至 1615 cm?1，这表明羟基和羰基官能团参与了 Li+的配位，有助于 Li-EGCG 纳米复合物的自组装和结构稳定。X射线光电子能谱 (XPS) 分析进一步证实了 O、C 和 Li 元素的存在，验证了 Li+在纳米结构中的成功整合。
2. Li-EGCG NPs 的广谱活性氧清除能力
氧化应激是 RGC 变性的一个关键病理因素，显著限制了移植细胞的存活和整合。为了应对这一挑战，系统评估了 Li-EGCG NPs 对代表性活性物质（包括 ABTS·+、DPPH·、·OH、·O2?、H2O2和 1O2）的广谱活性氧 (ROS) 清除能力。在浓度为 100 μg/mL 时，Li-EGCG NPs 对 ABTS·+的清除效率达到 75.6%。DPPH· 检测进一步证实了这种活性，Li-EGCG NPs 显示出明显的剂量依赖性清除效果，在 400 μg/mL 时达到 90.6%。使用水杨酸 (SA) 比色法和电子自旋共振 (ESR) 光谱评估了 ·OH 清除活性。在基于 SA 的检测中，随着纳米颗粒浓度的增加，吸光度显著降低，表明 Li-EGCG NPs 能有效中和 ·OH。通过硝基蓝四氮唑 (NBT) 测定和 ESR 评估了 Li-EGCG NPs 的 ·O2?清除能力，结果显示 DMPO-·O2?信号显著减弱。使用钛硫酸盐分光光度法 (TSS) 定量 H2O2清除能力，随着纳米颗粒浓度增加，观察到吸光度显著下降。使用 2,2,6,6-四甲基哌啶 (TEMP) 作为特异性自旋捕获剂，通过 ESR 评估了 Li-EGCG NPs 淬灭 1O2的能力，结果显示 TEMPO 信号强度显著降低。这些结果表明 Li-EGCG NPs 具有强大且广谱的抗氧化活性，能够中和多种 ROS。
3. ESC-RGCs 的分化及与 Li-EGCG NPs 的生物相容性
RGCs 是青光眼中主要受影响的神经元亚型，但可靠且可再生的 RGCs 的缺乏长期阻碍了机制研究和治疗开发。为了克服这一限制，本研究采用了从人胚胎干细胞 (ESCs) 生成 RGCs 的分化方案。使用全化学定义的、无血清的方案诱导 RGCs 分化，从而实现高效且可重复的谱系定向。为了促进细胞追踪和移植后体内监测，采用 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术，将 TdTomato 荧光报告基因敲入内源性 BRN3B 基因座。通过免疫细胞化学染色对多种 RGC 特异性标志物（包括 βIII-tubulin (Tuj1)、ISL LIM 同源框 1 (Islet1) 和 RNA 结合蛋白 mRNA 加工因子 (RBPMS)）进行了确认。为了确定 ESC-RGCs 安全有效的工作浓度，进行了剂量反应分析。使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 测定法测量了细胞活力。浓度为 25 μg/mL 被确定为耐受性良好，且对 ESC-RGC 活力没有显著降低。因此，权衡生物安全性和抗氧化功效，选择 25 μg/mL 作为所有后续实验的工作浓度。表达 TdTomato 的 ESC-RGCs 的荧光成像证实，用 EGCG 或 Li-EGCG NPs 处理不会损害细胞形态或轴突生长。
4. Li-EGCG NPs 的体外抗凋亡和轴突保护作用
为了在体外评估 Li-EGCG NPs 的神经保护功效，使用 H2O2在 ESC-RGCs 中诱导氧化损伤。使用末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 染色、蛋白质印迹、CCK-8 测定、ROS 探针染色、轴突分析和线粒体功能分析评估了其保护作用。EGCG 和 Li-EGCG NPs 均能显著减少 H2O2诱导的细胞凋亡，其中 Li-EGCG NPs 显示出更显著的抗凋亡作用。蛋白质印迹分析显示，H2O2暴露降低了 Bcl-2 的表达，同时增加了 Bax 和 cleaved caspase-3 的水平。EGCG 和 Li-EGCG NPs 均逆转了这些凋亡性变化，其中 Li-EGCG NPs 效果更显著。细胞活力测定进一步验证了这些发现，在氧化条件下，EGCG 和 Li-EGCG NPs 均显著提高了 ESC-RGCs 的存活率，Li-EGCG NPs 显示出更优的促存活效果。使用 CellROX（细胞溶质 ROS）和 MitoSOX（线粒体超氧化物）探针评估细胞内和线粒体氧化应激水平。EGCG 和 Li-EGCG NPs 处理均显著降低了 ROS 积累，但 Li-EGCG NPs 对氧化应激的抑制作用更强。为了在形态学水平上进一步研究神经保护作用，我们检查了 ESC-RGCs 中的轴突完整性。结果显示，与 EGCG 相比，Li-EGCG NPs 能更优地保护轴突形态，表现为更大的胞体面积、增加的轴突数量和更粗的轴突直径。使用生物透射电子显微镜 (Bio-TEM) 的超微结构分析进一步支持了这些观察结果。暴露于氧化应激的 ESC-RGCs 表现出明显的线粒体肿胀和嵴结构破坏。相比之下，Li-EGCG NPs 处理能显著保护线粒体形态和结构完整性，表现为线粒体肿胀显著减少和嵴密度增加。一系列线粒体功能测定进一步评估了线粒体完整性和生物能量状态。Li-EGCG NPs 处理显著恢复了细胞内 ATP 的产生，表明线粒体能量代谢得到改善。JC-1 染色显示，Li-EGCG NPs 处理组中 JC-1 单体形成显著减少，表明线粒体膜电位得到维持。此外，MPTP 测定显示，Li-EGCG NPs 有效抑制了线粒体渗透性转换孔 (MPTP) 的开放，反映了氧化应激下线粒体稳定性的增强。这些结果表明，Li-EGCG NPs 通过减轻氧化应激、抑制细胞凋亡、保护线粒体结构和功能以及维持轴突完整性，为 ESC-RGCs 提供了强大的神经保护作用。
5. Li-EGCG NPs 神经保护作用的机制研究
为了阐明 Li-EGCG NPs 在氧化应激下对 ESC-RGCs 神经保护作用的分子机制，我们通过 RNA 测序进行了转录组谱分析。主成分分析 (PCA) 显示两组之间存在明显分离，表明 Li-EGCG NPs 诱导了 ESC-RGCs 中显著的转录组重编程。差异基因表达分析鉴定出 Li-EGCG NPs 处理后有 4,411 个基因显著上调和 3,731 个基因下调。对上调基因进行的基因本体论 (GO) 富集分析显示，在调节凋亡信号、维持线粒体膜电位、细胞呼吸和线粒体转运等生物学过程中有显著富集。基因集富集分析 (GSEA) 进一步突出了与轴突导向和细胞代谢相关通路的正富集。热图显示线粒体相关的抗氧化酶（包括 SOD2、GPX4、PRDX3 和 NNT）的稳健上调，这些是线粒体氧化还原稳态和细胞存活的重要调节因子。线粒体为中心的调控网络与青光眼发病机制高度相关，因为线粒体功能障碍被认为是视网膜节细胞凋亡和轴突变性的上游驱动因素，最终导致不可逆的神经元损失。GPX4 作为线粒体脂质过氧化和氧化还原稳态的关键调节因子，在青光眼条件下显著下调，并与明显的线粒体超微结构异常相关。恢复 GPX4 表达已被证明可以抑制细胞凋亡和铁死亡，同时在多个实验模型中显著促进视神经再生、RGC 存活和视觉功能。同样，位于线粒体基质的超氧化物歧化酶 SOD2 在线粒体活性氧解毒中起着关键作用。SOD2 表达减少会激活促凋亡信号通路，表现为 Bax 水平升高和 Bcl-xL 表达降低，从而增加神经元对氧化应激诱导的细胞死亡的易感性。在 Li-EGCG NPs 组中观察到的线粒体抗氧化酶基因的协同上调，为抑制细胞凋亡、保护线粒体功能和维持轴突完整性提供了机制解释。京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 通路分析进一步证实了轴突导向、神经营养因子信号通路和 cAMP 信号级联等信号通路的富集，这些通路已知支持神经元分化、轴突延伸和应激抵抗。
6. 通过 Li-EGCG@ESC-RGCs 联合疗法恢复视觉功能
为了解决移植 RGCs 存活率低的问题，我们开发了一种整合 Li-EGCG NPs 与 ESC-RGCs 的组合策略。这种 Li-EGCG@ESC-RGCs 制剂旨在同时促进移植的 ESC-RGCs 的存活和功能整合，并保护缺血/再灌注 (I/R) 诱导的急性病理性青光眼损伤小鼠模型中的内源性 RGCs。为了评估 Li-EGCG@ESC-RGCs 疗法的系统生物安全性，我们进行了涵盖血液学分析、血清生化和组织病理学检查的评估。常规血液测试和生化参数未显示显著异常，表明无血液毒性或肝/肾功能障碍。此外，对主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织学检查显示，任何组均未出现炎症、坏死或结构异常迹象，证明了 Li-EGCG@ESC-RGCs 治疗策略良好的系统生物相容性。为了评估视觉功能恢复，我们进行了一系列行为和电生理测试。瞳孔光反射分析显示，I/R 损伤导致瞳孔明显扩张，表明光响应性 RGC 活动受损。使用 ESC-RGCs 或 EGCG@ESC-RGCs 治疗部分改善了这种缺陷。值得注意的是，Li-EGCG@ESC-RGCs 治疗组的小鼠表现出显著更大的瞳孔收缩，与健康对照组非常相似，表明对 RGCs 有更优的保护或功能整合。视觉悬崖测试进一步支持了联合疗法的疗效。I/R 小鼠在深度感知方面表现出明显缺陷，在安全平台上停留的时间显著更长。虽然 ESC-RGCs 和 EGCG@ESC-RGCs 部分改善了表现，但 Li-EGCG@ESC-RGCs 组显示出最显著的增强，表明视觉信号处理和空间辨别能力得到了更稳健的恢复。电生理记录证实了这些行为学发现。视觉诱发电位 (VEP) 显示 I/R 损伤显著降低了 P1-N1 波幅，反映了皮层对视觉刺激的反应减弱。类似地，视网膜电图 (ERG) 显示 I/R 损伤后 a 波和 b 波波幅显著下降，与视网膜功能受损一致。使用 ESC-RGCs 或 EGCG@ESC-RGCs 治疗部分恢复了这些电生理反应，而 Li-EGCG@ESC-RGCs 疗法导致 VEP 和 ERG 信号最显著的恢复。这些结果表明，Li-EGCG NPs 与 ESC-RGCs 的组合在视觉通路中赋予了增强的神经保护和功能挽救作用。
7. Li-EGCG@ESC-RGCs 疗法介导的视网膜形态学保护
为了进一步研究 Li-EGCG NPs 对 RGCs 的体内神经保护作用，我们在 I/R 诱导的视网膜损伤小鼠模型中评估了移植细胞存活率、RGC 特异性标志物表达、视网膜结构完整性和细胞凋亡。结果显示，与 ESC-RGCs 和 EGCG@ESC-RGCs 组相比，Li-EGCG@ESC-RGCs 治疗的视网膜中 TdTomato 阳性细胞数量显著更高，表明 Li-EGCG NPs 促进了移植细胞的存活和保留。此外，对泛神经元标记物 Tuj1 的免疫荧光染色显示，Li-EGCG@ESC-RGCs 组中有更稳健的轴突样突起和更高的细胞计数，表明 RGCs 的活力和轴突保护得到改善。苏木精和伊红 (H&E) 染色进一步证实了视网膜结构的优越保护，与其它治疗方法相比，Li-EGCG@ESC-RGCs 组神经节细胞层神经元密度更高。与此发现一致，视网膜层横断面免疫染色显示，Li-EGCG@ESC-RGCs 组中 Tuj1 阳性细胞数量显著更高，支持了这种组合疗法在结构水平上增强了 RGC 存活率的结论。通过 TUNEL 染色评估的凋亡细胞死亡在 Li-EGCG@ESC-RGCs 治疗后显著减弱，定量显示与 ESC-RGCs 和 EGCG@ESC-RGCs 组相比，TUNEL 阳性细胞显著减少。这些结果表明，Li-EGCG NPs 通过其抗氧化能力和线粒体保护机制，产生了强大的抗凋亡效应。
结论
本研究设计了一种独特的 Li-EGCG NPs 系统，将锂离子与 EGCG 整合到一个稳定的纳米复合物中，该系统表现出强大的广谱抗氧化活性和增强的神经保护功效。与游离的 EGCG 相比，Li-EGCG NPs 在体外能更好地保护 ESC-RGCs 免受氧化应激诱导的细胞凋亡和轴突变性，同时促进线粒体完整性，并在体内促进功能恢复。在视网膜缺血/再灌注损伤急性病理性青光眼损伤模型中，Li-EGCG NPs 与 ESC-RGCs 移植的组合疗法显著改善了细胞存活率、轴突保护和视觉功能恢复。这些发现强调了 Li-EGCG NPs 在支持内源性和移植的视网膜节细胞方面具有强大的协同效益，为视网膜神经退行性疾病的细胞治疗提供了一种有前景的纳米医学策略。
