《Advanced Science》：The Maize ZmbHLH118 Transcription Factor Regulates Vacuolar Nitrate Loading by the NO3? Transporter ZmCLCa
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本文报道了玉米中bHLH家族转录因子ZmbHLH118调控氮素利用效率(NUE)的全新机制。研究发现，ZmbHLH118通过直接抑制液泡膜硝酸盐转运蛋白ZmCLCa的表达，负向调控玉米的硝酸盐吸收和植株生长。这为阐明液泡硝酸盐储存的转录调控机制提供了新见解，并指出了提升作物氮肥利用率的潜在靶点。
1 引言
氮是植物生长发育不可或缺的必需元素。硝态氮是陆地作物主要吸收的氮源形式。液泡作为细胞内的主要储库，储存了细胞内约90%的硝态氮，对于调节细胞质硝态氮稳态和氮素再分配至关重要。位于液泡膜上的硝酸盐转运蛋白和通道负责将过量的硝态氮泵入液泡储存，并在氮素缺乏时释放出来。在模式植物拟南芥中，AtCLCa是研究最为深入的液泡硝酸盐转运蛋白之一，它以2NO3-/1H+反向转运体的形式，介导硝态氮向液泡内转运。然而，对于AtCLCa等转运蛋白的上游转录调控机制，尤其在作物中，仍然知之甚少。
植物通过复杂的信号网络感知和响应硝酸盐变化。质膜定位的双重亲和硝酸盐转运蛋白/感受器NRT1.1与细胞内的硝酸盐响应因子NLP构成硝酸盐信号传导的核心通路。此外，bHLH家族是植物中最大的转录因子家族之一，参与调控多种生理过程。近年来有研究报道bHLH转录因子通过与NLP蛋白互作参与硝酸盐信号调控。然而，bHLH转录因子是否以及如何调控液泡膜硝酸盐转运，在很大程度上仍是未知的。
本研究揭示了一个新的调控机制，即玉米bHLH转录因子ZmbHLH118通过直接抑制液泡硝酸盐转运蛋白编码基因ZmCLCa的表达，负向调控玉米植株生长和硝态氮含量，进而影响氮素利用效率和田间籽粒产量。
2 结果
2.1 ZmbHLH118负调控玉米生长和硝酸盐含量
研究者筛选到一个bHLH转录因子基因ZmbHLH118的过表达株系。在正常硝酸盐条件下，ZmbHLH118过表达植株表现出显著的生长抑制，地上部和根部生物量降低，硝态氮和总氮含量也显著下降，这种效应在根部更为明显。相反，一个EMS诱导的zmbhlh118-ems突变体在正常硝酸盐条件下比野生型生长得更好，生物量更高，但硝态氮和总氮含量无显著差异。这些数据表明ZmbHLH118负调控玉米植株的生长和硝态氮含量。
2.2 ZmbHLH118具有转录抑制活性并对硝酸盐波动有响应
亚细胞定位实验表明ZmbHLH118定位于细胞核。酵母转录活性分析显示ZmbHLH118具有转录抑制活性。qRT-PCR分析表明，ZmbHLH118在幼苗期主要在根中高表达。同时，长期缺氮会显著诱导ZmbHLH118的表达，而硝酸盐复供后ZmbHLH118的表达会被短暂诱导，这表明其表达受硝酸盐负调控。
2.3 ZmbHLH118过表达导致玉米转录组对硝酸盐的响应
对ZmbHLH118过表达植株根部的RNA-seq分析表明，在正常硝酸盐条件下有大量差异表达基因，KEGG和GO富集分析显示这些基因主要富集在氮代谢、离子转运、阴离子转运等通路。其中，一个编码CLC家族蛋白的基因ZmCLCa表达下调。系统发育分析表明，ZmCLCa是拟南芥AtCLCa和AtCLCb最接近的同源物，并且像AtCLCa一样，在其底物选择性滤器的关键位置含有一个保守的脯氨酸残基，这暗示其具有硝酸盐转运功能。
2.4 ZmbHLH118直接结合ZmCLCa启动子并负调控其表达
qRT-PCR实验证实，在正常硝酸盐条件下，ZmbHLH118过表达植株根中ZmCLCa转录水平显著降低，而zmbhlh118-ems突变体中ZmCLCa表达上调。双荧光素酶报告基因实验表明，ZmbHLH118可抑制由ZmCLCa启动子驱动的荧光素酶活性。通过酵母单杂交、染色质免疫共沉淀和电泳迁移率变动分析，研究者证实ZmbHLH118可直接结合到ZmCLCa启动子区含有E-box基序的P3片段上。此外，与ZmbHLH118序列相似的其他三个bHLH成员（ZmbHLH162、ZmbHLH164、ZmbHLH172）也能抑制ZmCLCa启动子活性，暗示可能存在功能冗余。
2.5 ZmCLCa定位于液泡膜且转录受硝酸盐正调控
亚细胞定位实验证实ZmCLCa定位于液泡膜。组织表达分析显示ZmCLCa在根中高表达。与ZmbHLH118相反，硝酸盐处理可显著诱导ZmCLCa的表达，而缺氮则会抑制其表达。
2.6 ZmCLCa正调控玉米生长和硝酸盐含量
利用CRISPR/Cas9技术构建的zmclca敲除突变体在正常硝酸盐条件下表现出生长抑制、生物量降低，以及硝态氮和总氮含量显著下降，尤其是在根部。过表达ZmCLCa并未显著改变植株的硝态氮和总氮含量。
2.7 ZmCLCa促进玉米根系硝酸盐吸收和氯酸盐抗性
利用15N标记的硝酸盐吸收实验发现，zmclca敲除突变体和ZmbHLH118过表达植株的根部硝酸盐吸收速率均显著低于野生型。此外，zmclca突变体和ZmbHLH118过表达植株对毒性类似物氯酸盐更加敏感，这表明ZmCLCa功能受损会影响液泡对硝酸盐（或氯酸盐）的装载和解毒能力。
2.8 ZmCLCa介导硝酸盐跨液泡膜转运
为验证ZmCLCa是否具有硝酸盐转运功能，研究者在拟南芥clca-3突变体及烟草叶片中瞬时表达ZmCLCa并进行膜片钳分析。结果表明，表达ZmCLCa的液泡表现出与AtCLCa类似的离子电流特性，证明ZmCLCa能够介导硝酸盐跨液泡膜向液泡内转运。
2.9 ZmbHLH118和ZmCLCa调控田间玉米生长与产量
田间试验表明，ZmbHLH118过表达植株和zmclca敲除突变体株高降低、果穗变小、单株产量显著下降。这些结果说明ZmbHLH118和ZmCLCa在调控玉米田间产量和氮素利用效率方面扮演重要角色。
2.10 ZmbHLH118对ZmCLCa的调控位于ZmNRT1.1B介导的硝酸盐信号下游但不依赖于ZmNLP3
硝酸盐感应和信号传导主要由质膜定位的感受器ZmNRT1.1B和胞内感应器ZmNLP3等介导。实验发现，在zmnrt1.1b突变体中，硝酸盐对ZmCLCa的上调作用和对ZmbHLH118的抑制作用均被削弱。然而，ZmCLCa的表达在zmnlp3.1突变体中未受影响，且ZmNLP3.1不影响ZmCLCa启动子活性。这表明ZmbHLH118-ZmCLCa模块位于ZmNRT1.1B介导的硝酸盐信号通路下游，但独立于ZmNLP3。
3 讨论
本研究在玉米中发现了一个新的转录调控模块：ZmbHLH118-ZmCLCa。ZmbHLH118作为转录抑制因子，在响应外界硝酸盐信号时，直接结合并抑制液泡膜硝酸盐转运蛋白编码基因ZmCLCa的表达。ZmCLCa是拟南芥AtCLCa/AtCLCb的功能同源物，定位于液泡膜，负责将硝态氮从细胞质转运至液泡储存。功能缺失的zmclca突变体或过表达ZmbHLH118均会导致植株硝酸盐吸收和储存能力下降，生长受阻，最终影响田间产量。这一发现揭示了液泡硝酸盐装载的关键转录调控机制，为理解植物细胞内硝酸盐稳态调控网络提供了新视角。同时，鉴定出的ZmbHLH118和ZmCLCa基因为通过基因工程手段改良玉米等作物的氮素利用效率提供了有价值的候选靶标。
4 方法
研究使用了玉米自交系B73和ND101等材料。通过转基因技术构建了ZmbHLH118过表达、zmclca、zmnrt1.1b、zmnlp3.1的CRISPR/Cas9敲除突变体，并利用EMS诱变获得了zmbhlh118-ems和zmclca-ems点突变体。研究综合运用了分子生物学、遗传学、生理学、转录组学、双荧光素酶报告基因、酵母单杂交、染色质免疫共沉淀、电泳迁移率变动分析、膜片钳电生理以及田间表型分析等多种技术手段来验证假设。
