《Advanced Science》：Coronavirus Nsp3 Hijacks CLTC to Modulate Autophagosome Nucleation for Promoting DMV Formation and Viral Replication
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这篇研究通过构建表达荧光标记蛋白的重组猫传染性腹膜炎病毒，首次实现了冠状病毒复制细胞器——双膜囊泡（DMV）形成过程的实时动态观测。研究发现，宿主蛋白网格蛋白重链（CLTC）与病毒非结构蛋白3（nsp3）相互作用，通过维持核心III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合体来调控自噬体成核，从而为DMV的组装提供前体膜结构。该工作揭示了冠状病毒劫持宿主自噬起始通路的新机制，并确立了CLTC及其介导的自噬体成核通路作为潜在的广谱抗冠状病毒药物靶点。
引言
冠状病毒是一类单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，对公共卫生构成重大威胁。病毒在复制过程中会诱导宿主细胞发生大规模膜重构，形成特征性的复制细胞器——双膜囊泡（DMV）。DMV直径通常在100-300纳米，由两层紧密贴附的膜构成，其功能是为病毒RNA复制提供一个受保护的微环境，以躲避宿主的天然免疫识别。病毒的非结构蛋白（nsps）在DMV的生物发生中起核心作用，其中nsp3和nsp4的共表达是诱导DMV形成的最小病毒组件集合。尽管已有研究，但调控DMV生物发生的分子机制和宿主细胞机器仍不完全清楚，主要障碍在于缺乏能够实时动态分析DMV形成的工具。
结果
构建新型重组FIPV Nsp3-ZsGreen病毒
为了实现对DMV的实时可视化并鉴定参与其生物发生的宿主因子，研究团队构建了一株重组猫传染性腹膜炎病毒（FIPV），在其nsp3蛋白的一个高变区（第173-180位氨基酸）插入了ZsGreen荧光蛋白标签，得到FIPV nsp3-ZsGreen病毒。该重组病毒在猫肾细胞（CRFK）中成功拯救，表现出与野生型病毒（FIPV WT）相似的细胞病变效应、复制动力学，并能诱导形成形态学上无法区分的DMV，证明该荧光标记未影响病毒的复制能力和DMV形成特性。
FIPV Nsp3-ZsGreen实现在冠状病毒感染过程中对DMV生物发生的实时可视化
利用该工具，研究证实了nsp3-ZsGreen荧光信号与DMV的标志物——双链RNA（dsRNA）以及内质网（ER）标记物存在显著的空间共定位。活细胞成像显示，感染后3小时即可检测到荧光信号，随后荧光斑点的强度和数量随时间推移逐渐增加，并在核周区域形成点状聚集。透射电子显微镜（TEM）和免疫电子显微镜（IEM）进一步证实了ZsGreen信号特异性地定位在DMV膜上。这些结果共同表明，FIPV nsp3-ZsGreen是研究冠状病毒感染过程中DMV生物发生动态的有力新工具。
鉴定与FIPV诱导的DMV相关的宿主因子及CLTC的功能验证
利用亲和纯化质谱（AP-MS）技术，研究人员系统筛选了与nsp3-ZsGreen锚定的DMV特异性相关的宿主蛋白，从中鉴定出40个候选因子。通过CRISPR/Cas9技术对其中21个候选基因进行逐一敲除的功能验证发现，敲除网格蛋白重链（CLTC）、CCT7、DEK、FN1、FN1B和RACK1会显著抑制FIPV的复制。其中，CLTC被选作深入研究的对象。共聚焦显微镜和免疫共沉淀（co-IP）实验证实，FIPV的nsp3蛋白与宿主CLTC蛋白存在强烈的共定位和直接的物理相互作用。
CLTC是冠状病毒感染的关键宿主因子
在CRFK细胞和人肝癌Huh-7细胞中敲除CLTC基因，能显著抑制FIPV和人冠状病毒229E（HCoV-229E）的复制，表现为病毒蛋白表达水平下降、病毒滴度降低以及病毒RNA合成受阻。相反，在野生型细胞中过表达CLTC则会促进病毒复制。广泛的抗病毒谱分析显示，CLTC的缺失对多种冠状病毒（包括α、β和δ属的代表毒株）的复制有抑制作用，但对水泡性口炎病毒（VSV）、伪狂犬病毒（PRV）等非冠状病毒的复制没有影响，表明CLTC是冠状病毒特异且保守的必需宿主因子。
CLTC敲除通过破坏DMV形成来抑制病毒复制
病毒感染阶段分析表明，CLTC敲除并不影响病毒的附着和内吞过程，但严重损害了病毒基因组的细胞内复制和子代病毒的释放。免疫荧光显示，CLTC缺失导致nsp3-ZsGreen与dsRNA的共定位显著减少。更重要的是，透射电镜观察发现，CLTC敲除细胞中感染诱导的DMV数量明显减少。通过nsp3/nsp4共表达体系进行的结构拯救实验证明，在CLTC敲除细胞中重新表达CLTC，可以恢复DMV的形成能力。此外，IEM显示在感染细胞中，CLTC蛋白被特异性募集到DMV附近。这些证据表明，CLTC对于DMV的组装至关重要，进而影响病毒的RNA合成。
Nsp3-CLTC相互作用的时空动态及分子图谱
时间进程分析显示，在FIPV感染过程中，内源性的CLTC会随时间从弥散的细胞质分布，逐渐被募集到nsp3-ZsGreen阳性的病毒复制位点。通过结构域映射分析，研究人员确定了FIPV nsp3上与CLTC相互作用的关键区域位于Ubl1-HVR和Ubl2-PLP2结构域。反过来，CLTC蛋白的N端结构域（1-494 aa）是其与nsp3结合的主要区域。
CLTC敲除通过抑制自噬的成核阶段来抑制病毒增殖
为了探究CLTC是否通过调控自噬影响病毒复制，研究使用了串联荧光mRFP-EGFP-LC3报告系统监测自噬流。在野生型细胞中，FIPV感染会导致黄色斑点（自噬体）大量积累，表明自噬体形成活跃但与溶酶体融合受阻，这与氯喹（CQ）处理的效果类似。然而，在CLTC敲除细胞中，这种病毒诱导的黄色斑点积累被显著抑制。进一步的蛋白印迹和自噬流分析（使用溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1）证实，CLTC缺失损害的是自噬体形成的上游步骤——成核阶段，而非下游的降解过程。机制上，CLTC敲除导致自噬起始核心复合物——III类PI3K复合体的关键组分（ATG14、BECN1和VPS34）表达下调，并且co-IP实验证实CLTC与这些蛋白存在物理相互作用。CLTC的缺失还导致ATG14和BECN1发生异常聚集。功能上，使用III类PI3K复合体抑制剂（如Com19）处理野生型细胞，可以模拟CLTC敲除的表型，抑制病毒复制；而在CLTC敲除细胞中使用自噬激活剂雷帕霉素则无法恢复病毒增殖。这些结果表明，CLTC对于维持自噬体成核至关重要，而冠状病毒正是劫持了这条由CLTC介导的自噬起始通路，来获取构建DMV所需的前体膜结构。
讨论
本研究开发了一种基于重组FIPV nsp3-ZsGreen的活细胞成像平台，首次实现了在真实病毒感染背景下对DMV形成动态的实时观测和宿主因子的靶向鉴定。利用该平台，研究揭示了一个此前未被认识的机制：冠状病毒通过其nsp3蛋白招募宿主CLTC蛋白。CLTC并非通过其经典的内吞功能，而是通过维持III类PI3K复合体的稳定和功能，来调控自噬体的成核。病毒进而劫持这些由CLTC参与形成的自噬前体膜，将其改造为自身复制所需的DMV。同时，病毒感染会阻滞自噬流，可能是一种主动策略，旨在将自噬膜“冻结”在扩张阶段以供DMV组装，并避免被溶酶体降解。这项工作不仅拓展了对冠状病毒复制细胞器形成机制的理解，也将CLTC及其介导的自噬体成核通路确立为潜在的广谱抗冠状病毒药物靶点。未来研究需要进一步解析nsp3-CLTC相互作用的高分辨率结构，并在更多生理相关的人类细胞模型和冠状病毒中验证这一机制的普遍性。
