《Advanced Science》：Engineered Living Systems With Self-Organizing Neural Networks: From Anatomy to Behavior and Gene Expression
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这项研究开创性地构建并表征了一种名为“神经机器人”的全新型生物机器人，它由非洲爪蟾胚胎的外胚层组织和神经前体细胞复合而成。作者们证明，这些植入的细胞能在新颖的运动“躯体”中自主分化成具有轴突和树突的功能性神经元，形成突触结构并表现出钙活性。与不含神经元的对照组相比，神经机器人展现出独特的形态、更复杂的自发运动模式，并对神经活性药物有不同反应。转录组学分析进一步揭示了神经机器人中与神经系统发育相关的基因显著上调，并意外地富集了视觉感知通路。这项工作为研究神经网络在非天然生物体架构中的自发组织、功能及其对行为和整体系统的影响，提供了一个极具前景的实验平台，对发育生物学、再生医学和合成生命系统设计具有重要启示。
引言
本研究旨在建立一个全新的、全生物模型系统，用以探究在新颖的运动生命体中自组织神经网络的形态与功能，以深化对神经系统进化发育生物学的理解，并为未来带神经支配的生物机器人设计提供信息。现有模型，如二维神经元培养和三维脑类器官，虽然功能强大，但缺乏运动能力和独立产生感觉运动行为的能力。而由肌肉或神经肌肉驱动的生物混合机器人又非完全由生物组织构成，且不能自我组装。本研究基于先前工作，即从晚期囊胚期非洲爪蟾胚胎动物极分离的外胚层组织可在体外发育成能自主运动的黏液纤毛表皮类器官（简称为“生物机器人”）。在此基础上，研究者探索了若为这些生物机器人提供构建神经系统的原料（即神经前体细胞）会发生什么。
结果
2.1 通过将外源性神经前体植入非洲爪蟾外胚层外植株中构建神经机器人
为研究在新型躯体中自组装神经系统的结构与功能，研究者建立了一种在生物机器人形成初期植入神经前体细胞的实验流程。结果表明，植入神经前体细胞的神经机器人与不含神经元的生物机器人在形态上存在显著差异：到第6天，神经机器人倾向于呈现更细长的形状且体积显著更大。作为对照的“假神经机器人”（植入未诱导神经命运细胞团）则未显示出这种差异，表明形态变化可能与神经元生长有关。
2.2 植入的神经前体细胞分化为神经元，并向神经机器人内部及表层细胞发出投射
通过特异性结合乙酰化α-微管蛋白的抗体进行染色（该蛋白在神经元和多纤毛细胞中大量存在），研究者确认植入的细胞确实分化成了神经元。这些神经元不仅向神经机器人内部延伸突起，也向表层细胞发出投射（图2c,d箭头所示），提示神经元可能调节表面效应器（如多纤毛细胞或调节纤毛搏动频率的小分泌细胞）的活性。进一步的MAP2和synapsin-1共标记显示，神经机器人内发育出了轴突、树突区室和突触前结构。不同神经机器人的神经网络结构存在显著差异，但神经突起往往从一个或多个细胞核区域（推测为植入的细胞团）发出。有趣的是，这些区域周围常存在看似无细胞核染色的空间，可能包含细胞外基质（ECM）或其他支持结构。
2.3 神经机器人中的神经元具有功能
为了评估神经元的功能性，研究者利用表达基因编码钙指示剂（GCaMP6s）的胚胎细胞构建神经机器人，并在其自由运动时进行钙成像。结果显示，植入的细胞确实表现出钙活性，偶尔还能观察到附近或遥远区域间的同步活动，表明可能存在神经元间的连接。
2.4 与无神经元的生物机器人相比，神经机器人往往更活跃且运动更复杂
研究者记录并比较了神经机器人和生物机器人的自发运动。分析发现，神经机器人的运动轨迹复杂度指数显著更高，且其最小运动速度也更高，表明它们更少处于静止状态。这种复杂度的增加与机器人的圆度或大小无关，可能源于神经元活动对运动的调节作用，或神经元存在导致的多纤毛细胞分布或活性的改变。
2.5 诱导癫痫发作的药物对神经机器人和生物机器人的行为产生不同影响
为了进一步探究神经活动是否在调节运动复杂性中发挥作用，研究者使用了GABAA受体拮抗剂戊四氮（PTZ）。结果显示，PTZ处理显著降低了大多数生物机器人的运动复杂度。然而，对神经机器人的影响则呈现分化：多数神经机器人的复杂度相对增加，少数降低。总体而言，PTZ处理后，神经机器人的相对复杂度显著高于生物机器人。这种差异效应表明，神经元活动可能对抗了PTZ对生物机器人运动的默认抑制作用，或神经存在间接改变了表面效应器（如多纤毛细胞）的表达或分布。
2.6 神经机器人中多纤毛细胞的分布存在显著差异，其圆度与神经表达程度呈负相关
通过量化免疫染色图像中的神经突起长度、末端数量和多纤毛细胞（MCC）数量，研究者发现神经突起密度与MCC表达密度呈显著负相关：神经突起越密集，MCC密度越低。同时，神经机器人的圆度指数与神经突起的绝对长度、标准化长度以及末端总数均呈显著负相关，即神经机器人越细长，其神经表达量越高。这进一步支持了形态变化由内部神经生长引起的假设。使用选择性5-HT1B/1D受体激动剂佐米曲坦培养的神经机器人，其神经生长程度有所增加。
2.7 三种类型的机器人表现出显著不同的基因表达模式
通过批量RNA测序比较神经机器人、生物机器人和假神经机器人的转录组，研究者发现神经机器人的基因表达与另外两组差异显著。神经机器人样本间的基因计数变异性显著更高。差异表达基因分析显示，与另外两组相比，神经机器人中有大量基因显著上调，呈现明显的功能获得特征。基因本体富集分析表明，神经机器人中上调的基因显著富集于神经系统发育、突触组织、神经元投射和跨突触信号等通路。令人惊讶的是，与视觉感知相关的通路也显著富集，包括多种视蛋白（如红色和紫色视锥蛋白、黑视蛋白、视紫红质）及视网膜发育相关基因。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步确认了这些功能模块，并揭示了与细胞外基质成分相关的基因也显著上调。系统发育地层学分析表明，神经机器人中上调的基因更多地属于最古老的基因类别（“所有生物”和“真核生物”），暗示这种新型构造的转录组有向进化史更早期状态“回溯”的趋势。
讨论
本研究构建并研究了这种具有整合神经组织的新型生命构造的行为、解剖和转录特性。神经机器人表现出更大的个体差异性，其神经网络的变异可能源于植入细胞团的大小差异和细胞来源的遗传异质性。未来通过自动化方法植入确定数量的细胞将有助于减少变异并量化生长关系。神经元突起向表层上皮的延伸提示其可能调节外部细胞类型的活动，未来可通过光遗传学激活等方法验证其因果关联。尽管神经机器人的运动模式更多样复杂，但将神经活动与行为直接关联仍面临技术挑战，例如在自由运动的神经机器人中进行稳定的钙成像。转录组学分析不仅证实了神经相关通路的激活，还意外揭示了视觉感知基因的上调，这为探索神经机器人是否具有光调节行为这一全新涌现功能提供了令人兴奋的方向。此外，神经机器人基因表达变异性的增加，可能反映了神经系统对细胞行为的广泛影响，或在应对进化未经历的新型压力时，细胞采取的随机基因表达探索策略。总体而言，这项研究建立了一个模型系统和实验路线图，用于理解生命体进化硬件在发育（而非进化）时间尺度上的可塑性，并为合成生命机器提供了具有新型控制潜力的生物接口，同时为神经系统创新的起源提供了见解。
