《Advanced Science》：Semiconducting Polymer Nanoparticles Enable Light-Controlled Bidirectional Modulation of Nitric Oxide in Endothelial Cells
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本文展示了一种创新的基于聚(3-己基噻吩)和PEDOT:PSS复合纳米颗粒（3P NPs）的策略，利用光控实现内皮细胞内源性一氧化氮（•NO）的可逆双向调节。在黑暗条件下，NPs内化通过活性氧（ROS）依赖途径上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），提升•NO水平；光刺激则通过ROS介导的清除作用和iNOS下调降低•NO。该技术为心血管疾病等需要精确•NO调控的领域提供了高时空分辨率的新工具。
1 引言
一氧化氮（•NO）是血管系统中的关键信号分子，通过浓度依赖性方式调控血管生成、血管张力和内皮屏障完整性等关键细胞功能。内皮功能障碍是心血管疾病、血管性痴呆和神经退行性疾病的标志，常伴随•NO生物利用度的严重受损。因此，增强内源性•NO产生被视为恢复内皮信号传导和降低心脏代谢风险的最合适治疗策略之一。然而，•NO信号具有双峰性，其细胞效应高度依赖于局部浓度：生理水平的•NO支持稳态和血管健康，而浓度过高则可能导致氧化应激和病理过程。这突显了对能够精确、可逆地调控细胞内•NO水平的工具的需求。
当前的药理学干预措施旨在通过提供•NO供体或增强•NO合成的药物来增加•NO，或通过使用•NO清除剂和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂来消耗•NO。但这些方法通常缺乏空间和时间分辨率以及可逆性。光生物调节利用特定波长的光刺激内源性NOS活性，但通常只能引起•NO水平的适度变化，且疗效限于狭窄的波长范围。整合光响应纳米材料为克服这些限制提供了前景。
本研究中，我们利用基于聚(3-己基噻吩)的纳米颗粒（P3HT NPs）能够在细胞内按需可靠调节ROS水平的能力，来调控关键的氧化还原信号介质，特别是•NO。我们提出一种结合材料介导的内源性•NO产生刺激与光驱动调节的新策略，使用单一材料界面实现内源性•NO水平的双向、可逆控制。
2 实验结果
2.1 基于聚(3-己基噻吩)纳米颗粒的合成与表征
本研究采用新型纳米颗粒（3P NPs），它基于光电化学活性成分P3HT和作为细胞相容性导电聚合物的聚(3,4-乙撑二氧噻吩):聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）。这些NPs通过双乳液法合成，并进一步引入磷酸钙封端层以提高其应用潜力。如图1所示，3P NPs水分散体的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱显示出P3HT NPs的典型特征，吸收峰在520、560和610 nm附近，发射峰和肩峰分别在640和700 nm。动态光散射测得3P NPs的平均流体动力学直径为296 ± 66 nm，平均多分散指数为0.22 ± 0.04。在水性胶体分散体中，3P NPs保持了产生光电流的能力，这归因于光生电子与介质中溶解的分子氧之间发生的氧还原反应。
2.2 纳米颗粒光刺激对内皮细胞•NO的双向调节
以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究模型。如图2所示，共聚焦显微镜图像证实了3P NPs被高效内化并定位于细胞质中，未发现穿过细胞核的证据。使用可渗透细胞的荧光探针DAF-FM-DA评估了3P NPs在黑暗和光激发条件下对细胞内•NO水平的影响。结果显示，在黑暗条件下，仅用3P NPs处理会导致•NO显著增加，与黑暗对照相比约增加50%。相反，3P NPs的光刺激则导致•NO显著降低，与3P黑暗条件相比降低约55%，与对照黑暗条件相比降低约30%。重要的是，这种光刺激引起的•NO降低代表了一种将细胞内•NO水平主动逆转至基础条件以下的效应。
为了测试ROS光生成本身是否导致了这种效应，我们使用了高效的ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）。如图3所示，在NAC存在的情况下，无论•NO水平是降低（NPs加光激发）还是增加（黑暗条件下的NPs），都能确定性地使•NO恢复到基础浓度。这表明ROS在•NO的两种方向调节中都起着关键作用。
此外，使用单独的P3HT NPs进行的类比实验显示，其内化同样导致•NO水平增加，而光刺激则导致•NO相对减少。这表明P3HT是观察到的•NO调节的主要成分。在第二种内皮细胞模型——小鼠心脏微血管内皮细胞系（H5V）中进行的初步定性研究也观察到了与HUVECs完全相似的行为。
总结而言：1) 3P NPs的内化显著增加了内源性细胞内•NO水平；2) 3P NPs的光刺激使细胞内•NO浓度降低至基础水平以下；3) 聚合物NPs介导的•NO增加和减少都与ROS生成紧密相关；4) 观察到的•NO双峰调节不依赖于3P NPs的结构组织或PEDOT:PSS组分，而是由P3HT组分的光催化活性驱动。
2.3 3P NPs诱导内源性糖酵解代谢转变
我们通过时间分辨光致发光（TRPL）光谱评估了细胞的代谢状态，以监测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的代谢。NADH以游离和酶结合两种主要形式存在，其荧光寿命不同。游离NADH比例（f1）的增加反映了细胞代谢向糖酵解的转变。如图4所示，无论是否进行光激发，用3P NPs处理总体上都会显著增加游离NADH池，表明NPs内化导致代谢略微（<10%）向糖酵解方向转变，但仍保持在典型的与氧化还原介导的良性应激相关的范围内。在光刺激下，我们观察到f1值相比未光照的NPs有所降低，表明代谢相对向氧化磷酸化（OXPHOS）回转，证实了聚合物NPs在黑暗或光刺激下所实现的双向效应。
为了阐明这种代谢转变是内源性还是外源性•NO来源驱动的，我们进行了TRPL测量。用外源性过氧化氢（H2O2）或•NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）处理的细胞均诱导向OXPHOS的代谢转变。这与NPs内化后观察到的糖酵解转变形成对比，突显了外源性补充的ROS/•NO与其内源性对应物在影响细胞代谢方面的根本区别，进一步支持了NPs内化后ROS/•NO增加源于细胞内调节机制的假说。
2.4 通过eNOS和iNOS免疫染色识别•NO来源
我们通过免疫荧光研究评估了主要一氧化氮合酶亚型的表达。如图5所示，与基础值相比，无论是否进行光刺激，NP处理条件下内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达均显著增加（约+50%）。这种上调可能是对NPs内化诱导的适度氧化还原扰动的一种代偿反应。在黑暗条件下，用3P NPs处理的细胞也显示出诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达显著增加（约+40%），这可能由氧化还原敏感转录因子NF-κB驱动。在NPs光刺激下，iNOS表达显著降低，恢复到与未处理对照相当的值。这种光诱导的抑制反映了观察到的•NO水平下降和代谢向OXPHOS的逆转。
总体而言，这些结果表明，在无光刺激的情况下，NPs内化诱导了eNOS和iNOS表达的上调，可能通过ROS依赖性信号通路增强•NO产生。光刺激引发了一种保护性反应，其中eNOS表达得以维持，而iNOS通过ROS介导的NF-κB抑制而下调。我们提出，NOS亚型表达的这种光依赖性转换可能是促成内皮•NO水平双向控制的关键机制。
3 讨论与结论
•NO是一种多方面的信号分子，其生物学效应高度依赖于浓度。目前，许多方法可以实现细胞内•NO浓度的单向调节，例如各种•NO释放平台和供体。然而，大多数这些系统无法精确调节•NO释放的持续时间和/或幅度，并且本质上缺乏双向性。
在本研究中，我们提出了一种策略，将纳米材料效应与光刺激效应分离开来。具体来说，我们使用光活性聚合物NPs来刺激内源性•NO产生，然后利用光作为调节工具实现•NO水平的可逆、双向调节。我们选择了基于P3HT和PEDOT:PSS的复合3P NPs作为半导体和导电材料，它们显示出优异的光电化学性能和细胞相容性。
我们证明了NPs内化能稳健地增强HUVECs和H5V细胞中的细胞内•NO水平。相反，在光刺激下，NPs诱导•NO浓度降低至基础水平以下，从而实现空间选择性的双峰•NO调节。通过使用NAC作为ROS清除剂，我们为黑暗和光照条件下•NO调节与ROS生成之间的因果关系提供了有力证据。
这些结果支持了一种ROS介导的细胞内•NO双重调节机制，其生物学结果取决于产生的ROS的强度。在黑暗条件下，NPs内化诱导轻度氧化应激，激活氧化还原敏感信号通路并促进NOS活性，导致内源性•NO产生增加。相反，在光照下，光激发的NPs产生显著更高的ROS通量，导致细胞内•NO水平下降。ROS在两种条件下都起着因果作用，黑暗条件可能涉及内源性物种（如H2O2）作为信号介质，而光刺激则诱导额外的外源性、短寿命、高活性物种（例如超氧化物衍生的氧化剂）形成，这些物质能够消耗•NO。
TRPL测量显示，在无光条件下，NPs内化诱导代谢向糖酵解转变，而光刺激则部分逆转这种效应，细胞表现出OXPHOS活性增加。免疫染色研究表明，黑暗条件下NPs内化伴随着eNOS和iNOS的显著上调。iNOS表达的增加可能归因于NPs摄取后ROS的适度积累。eNOS的同步上调可能代表了对良性应激氧化还原失衡的代偿性促稳态反应。光刺激后，iNOS表达被显著抑制，而eNOS表达与NPs黑暗值相比没有显著变化。这表明eNOS表达不是NPs光刺激下细胞内•NO动态变化的主要驱动力，iNOS和ROS才是•NO减少的主要调节因子。
总之，这项工作凸显了3P NPs作为一种创新平台的潜力，用于在内皮细胞中实现可逆的、光可控的、双峰的•NO调节。该系统作为一种双相治疗工具，在黑暗条件下增强•NO产生，在光刺激下下调之。我们方法在时间上精确且可逆地调节内皮反应的能力，为其在各种氧化还原相关病理中的应用开辟了道路。重要的是，它确保了•NO在早期保护阶段被有益利用，同时避免了在后期可能导致炎症或氧化应激的长时间或过度暴露。
