《Advanced Science》：Maize Anther Development Involves Translated Open Reading Frames From 3′ Untranslated Regions
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本研究通过整合RNA测序（RNA-seq）和核糖体印记测序（Ribo-seq），系统分析了玉米（Zea mays）花药十个发育阶段中的翻译调控动态。文章揭示了从5'和3'非翻译区（UTR）翻译的开放阅读框（ORFs）的新功能，其中3' UTR来源的ORFs与雄性不育相关，并以克隆的APV1基因座为例。研究还发现花药光合效率较低，存在不同于典型C4光合作用的CO2同化途径。该研究为理解花药发育的翻译调控提供了新见解，并指出了利用3' ORFs创制雄性不育玉米品系的潜在策略。
玉米花药发育的翻译调控景观
玉米的雄性不育系是其育种和种子生产的关键组成部分。理解雄性生殖器官——花药的发育，对于创制新的雄性不育系至关重要。玉米花药发育可分为14个阶段，转录组分析将这些阶段归纳为四个主要时期：细胞命运与分化（时期I，0.2–1.3毫米）、减数分裂（时期II，1.5–3.0毫米）、花粉成熟（时期III，4.0毫米）和成熟花粉（时期IV）。尽管转录调控已被广泛研究，但花药发育过程中的翻译调控仍知之甚少。核糖体印记（Ribo-seq）是一种在研究植物发育过程中翻译调控的强大方法。
花药发育时期的划分与翻译动态
为了探究玉米花药发育过程中基因翻译的动态变化，研究团队系统分析了代表花药十个发育阶段的组织的Ribo-seq和RNA-seq数据。核糖体足迹显示出预期的25–33碱基对的尺寸分布，并主要映射到具有强三核苷酸周期性的编码序列上，这是活跃核糖体翻译的标志。主成分分析证实了生物学重复的紧密聚类，而不同发育阶段的样本则被清晰区分。结合重复间>96%的相关性，这些发现表明转录组和翻译组数据集具有高度可重复性，适合进一步分析。
基于转录和翻译基因的数量，研究将十个花药发育阶段划分为五个时期（时期I-V）。翻译基因的数量（每个花药样本约18,000个，花粉中约7,000个）低于转录基因的数量（每个花药样本约22,000个，花粉中约8,000个）。总体上，花药中约80%的转录基因被检测为翻译，而约95%的翻译基因得到了转录组数据的支持。这些比例在花粉中较低。
转录组与翻译组的比较
为了表征花药发育过程中基因翻译表达的动态，研究基于翻译效率（TE，定义为核糖体足迹与mRNA丰度的比值）进行了基因共表达分析。根据其TE，基因被分为18个共表达簇。对前十个时期特异性簇的基因本体（GO）富集分析揭示了与不同发育时期相关的独特生物学功能。值得注意的是，在时期IV（5.0毫米花药），与“翻译”相关的基因显著富集。TE值与翻译或转录水平之间的相关性分析显示，从时期I到时期IV，TE与翻译水平呈正相关，但这种关系在时期V发生了逆转。
为了比较不同时期在转录和翻译水平上的差异，研究对转录组和翻译组数据集进行了基因共表达和GO富集分析。结果显示，在早期时期，翻译调控对基因表达控制有显著贡献，而在后期时期，特别是花粉中，富集模式基本一致。
翻译调控在玉米花药发育中的功能
研究接下来检查了翻译调控对十个发育阶段全局基因表达的影响。翻译调控的差异反映在TE的变化上，预计这将增加翻译组相对于转录组的整体表达变异。研究估计，翻译调控使十个阶段的表达变异增加了11%–56%。翻译调控的影响在时期II的1.5毫米花药阶段和时期IV最大。基因的TE在减数分裂期间相对较低，在1.5毫米阶段达到最低，而在时期IV最高。这与之前的观察一致，即时期IV富集的基因主要参与“翻译”这一GO条目。
研究识别出2544个基因为高TE基因（TE > 2）。例如，Zm00001eb212800（MS28）在时期I转录水平相对较低，但其TE超过5。MS28的功能缺失会导致花粉不育。另一个关键基因MS26在时期II高表达，其翻译水平是转录水平的四倍。MS26的突变也会导致雄性不育。同样，时期II的高TE基因DRP1与雄性不育相关。在花粉中，RALF2的翻译水平是其转录水平的三倍，ralf2/3突变导致花粉管破裂。
相比之下，939个基因被归类为低TE基因（翻译水平低于转录水平的一半）。一个典型例子是编码花药特异性蛋白Ms44的基因Zm00001eb198610，该基因在2.0毫米阶段显示出非常高的转录水平但较低的翻译水平，Ms44中的单碱基替换会导致雄性不育。此外，91个基因表现出波动的TE。推测具有高或低TE的基因可能在花药发育中起重要作用。总共有34个不育相关基因相对于背景显著富集。
与雄性不育相关的基因主要富集在时期I和时期II。GO富集分析表明，这些基因主要参与蛋白质降解和碳水化合物代谢。这些发现表明，在花药发育后期参与生物合成和能量转换的基因对于正常育性至关重要。例如，PME/PMEI基因家族参与花药和花粉中的果胶合成，有助于授粉和花粉管伸长。另一个基因家族SWEET编码跨浓度梯度双向跨膜运输糖类的糖转运蛋白。在拟南芥中，AtSWEET5、AtSWEET8、AtSWEET13和AtSWEET14对于正常花药发育至关重要。通过比对，研究推测ZmSWEET6a/b和ZmSWEET15a/b可能在花药发育中起关键作用。ZmSWEET15a/b在时期II显示出特别高的TE。功能分析表明，sweet15a/b双突变体比野生型或单突变体产生更多淀粉填充不完全的成熟花粉粒，而植株表型、雄穗生长和花药开裂不受影响。
翻译调控也差异性地影响与雄性不育相关的功能冗余基因的表达。例如，tga9-1/2/3三突变体而非单或双突变体表现出雄性不育。其中，只有TGA9-1在时期I显示出明显的高TE。同样，tkpr1-1/-2双突变体而非单突变体表现出完全雄性不育。tkpr1-1/-2的不育表型源于编码蛋白的缺陷而非转录减少。翻译调控提高了ZmTKPR1-1的TE，同时降低了ZmTKPR1-2的TE，尽管这两个基因在转录上都被ZmMYB84激活且功能冗余。总之，TE的差异，无论是高还是低，都在花药发育中起着关键作用，并可能是冗余基因间不同表达模式的基础。
玉米花药进行着较低效率的光合作用
GO富集分析表明，与光合作用相关的基因在时期III富集。叶绿素荧光显示，花药在4.0毫米阶段（时期III）之后具有与成熟玉米叶片相当的光合潜力。花药的电子传输速率（ETR）低于成熟叶片，这可能反映了花药中的叶绿体比叶片叶绿体含有更少的成熟基粒片层和更多的原片层体。此外，光合作用关键限速酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）的催化活性在花药中低于叶片。这些结果表明花药的光合效率显著较低。
有趣的是，在花药的连接组织和花药裂片近轴面的相邻区域观察到了少量的气孔，类似于玉米叶片表皮的气孔。此外，β-碳酸酐酶（β-CA）家族成员Zm00001eb158800即使C4型β-CA基因几乎不表达，也以高效率被翻译。利用微气体交换系统测量玉米花药的净光合速率数据显示，花药以非常弱的程度同化CO2，净光合速率为负值。这些观察结果表明，花药能以低效率进行光合作用，并通过不同于典型C4光合作用的途径同化CO2。
5‘ ORFs和3’ ORFs的不同特征可能对mORF翻译产生相反影响
核糖体印记能够识别全基因组范围内的可翻译ORFs。为了研究这是否发生在花药发育过程中，研究识别出761个、175个和268个分别位于5‘ UTRs、3’ UTRs和注释非编码区域的翻译ORFs。当这些ORFs共享终止密码子且其非重叠序列显示三核苷酸周期性时，被定义为5‘ ORFs、3’ ORFs或非编码ORFs。对第一个AUG周围的Kozak序列特征分析显示，这些ORFs具有与蛋白质编码基因的mORFs相似的强翻译潜力。
具有强Kozak特征的含5‘ ORFs基因的TE高于缺乏这些特征的基因。然而，无论是否存在强Kozak特征，含3’ ORFs基因的TE没有显著差异。分析显示，与不含5‘ ORFs的基因相比，含5’ ORFs的基因表现出较低的TE，并且5‘ ORFs的数量可能与较低的TE相关。而含3’ ORFs的基因则表现出相反的趋势，且这种效应不依赖于3‘ ORFs的数量。此外，基因的TE与其3’ ORFs的长度呈负相关，而5‘ ORFs的长度没有影响。这些发现表明，具有不同特征的5’和3‘ ORFs对基因翻译有相反的影响。
由于识别出的5‘ ORFs位于其同源基因的UTRs中，研究推测它们可能像uORFs一样抑制mORFs的翻译。然而，没有观察到5’或3‘ ORFs的翻译水平与其对应基因的TE之间存在强负相关。为了测试特定5’ ORFs是否影响其同源mORF的翻译，研究选择了三个基因——Zm00001eb376970、Zm00001eb291900和Zm00001eb233060，并将它们的5‘ ORFs插入荧光素酶报告载体中。这些构建体通过农杆菌介导的转化引入烟草叶片。与负对照和空载体相比，+5’ ORF构建体的LUC荧光强度显著降低，表明基因UTR中的5‘ ORFs抑制下游mORF的翻译。对于测试的三个基因，完整和突变的5’ ORFs之间的mRNA水平没有显著差异，空载体、+5‘ ORF和-5’ ORF构建体之间的LUC mRNA水平也没有显著差异。这些结果表明，5‘ ORFs对下游翻译的抑制发生在翻译水平而非转录水平。
来自翻译3‘ ORFs的独立异构体可能影响花药发育
研究通过分析全长转录组数据，手动检查了所有识别出的ORFs的基因结构特征。其中52个ORFs恰好对应于已知基因的新识别异构体。一个例子是Zm00001ed260510的5‘ ORF，被检测到与在九个花药发育阶段表达的独立异构体重叠。另一个来自Zm00001eb297540的3’ ORF的新异构体在4.0毫米和5.0毫米花药以及花粉中表达。此外，来自Zm00001ed260510的5‘ ORF和八个3’ ORFs（包括Zm00001eb297540的3‘ ORF）被验证为从含有1.5–2.0毫米花药的穗中获得的质谱数据翻译成肽。总共识别出123个翻译ORFs。这些发现表明，UTR内的一些ORFs可能独立于其同源基因进行翻译。
有趣的是，抑制其对应基因翻译的Zm00001eb233060的翻译5‘ ORF也被转录为新识别的异构体。然而，这些来自UTR的独立翻译ORFs是否在玉米花药发育中具有功能尚不清楚。对5’和3‘ ORFs编码的肽段进行全基因组BLASTP搜索发现，由Zm00001eb417050的3’ ORF编码的肽段在时期II的2.5毫米和3.0毫米阶段的花药中以异常高的水平表达。该肽段与Iso-Seq检测到的异构体匹配，并与APV1有94%的序列相似性。APV1含有细胞色素P450超家族结构域。APV1（对应于3‘ ORF）的65个氨基酸缺失突变体和由单碱基插入引起的移码突变都导致花粉成熟缺陷和雄性不育。这些发现表明，UTR内的3’ ORFs编码的功能性异构体可能在玉米花药发育中起重要作用。
