双氢青蒿素通过激活SIRT1/FOXO1/SLC7A11/GPX4通路抑制神经元铁死亡，缓解癫痫小鼠发作与认知损伤

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Dihydroartemisinin Alleviates Neuronal Damage and Seizures in Epileptic Mice by Inhibiting Ferroptosis via the SIRT1/FOXO1/SLC7A11/GPX4 Pathway

推荐阅读：本研究揭示双氢青蒿素(DHA)在癫痫治疗中的新机制。文章证实DHA可通过激活SIRT1，促进FOXO1去乙酰化，上调溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达，从而有效抑制神经元铁死亡，显著改善海马卡因酸(KA)诱导的癫痫小鼠的自发性反复发作(SRSs)和莫里斯水迷宫(MWM)测试中的学习记忆障碍。该发现为癫痫，尤其是耐药性癫痫的药物治疗提供了创新性靶点和潜在候选药物。

　　

背景

癫痫是一种以反复自发性发作为特征的常见神经系统疾病，全球影响约7000万人。尽管现有多种抗癫痫药物，仍有约30%的患者无法有效控制发作。颞叶癫痫(TLE)是最常见的类型，给患者带来严重负担。铁死亡是一种新发现的、以脂质过氧化和铁依赖性活性氧(ROS)积累为特征的细胞死亡方式，已被证实与癫痫的发生发展密切相关。双氢青蒿素(DHA)是青蒿素衍生物，除抗疟外，在神经保护方面也显示出潜力。本研究旨在探讨DHA是否通过抑制铁死亡来发挥抗癫痫及神经保护作用。

材料与方法

研究采用海马卡因酸(KA)诱导的癫痫小鼠模型和谷氨酸(Glu)处理的HT22细胞模型。动物实验将小鼠分为对照组、KA组、KA+铁死亡抑制剂(Fer-1)组、KA+DHA组，以及KA+DHA+SIRT1抑制剂(EX-527)组。通过腹腔注射给药，观察行为学改变。使用视频监控记录小鼠30天内的自发性反复发作(SRSs)水平，并采用拉西内分级评估癫痫严重程度。认知功能通过莫里斯水迷宫(MWM)测试评估。神经元损伤通过尼氏(Nissl)染色观察。采用蛋白质印迹(WB)和免疫荧光(IF)检测海马组织中SIRT1、FOXO1、乙酰化FOXO1(Ac-FOXO1)、SLC7A11和GPX4的蛋白表达。通过透射电镜(TEM)观察线粒体形态。使用商用试剂盒检测海马组织和HT22细胞中的亚铁离子(Fe²⁺)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4HNE)、超氧化物歧化酶(SOD)水平及ROS积累。采用定量实时逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测SLC7A11的mRNA水平。利用分子对接分析DHA与SIRT1的结合活性。通过染色质免疫沉淀(CHIP)-qPCR验证FOXO1与SLC7A11启动子的直接结合。此外，还收集了TLE患者和创伤性脑损伤(TBI)患者的脑组织样本，以验证铁死亡相关标志物的表达。

结果

1. 1.
   DHA缓解癫痫表型与认知功能障碍：行为学结果显示，与KA组相比，DHA或Fer-1处理显著延长了小鼠SRSs的潜伏期，并减少了观察期最后7天的SRSs发作次数。MWM测试表明，DHA或Fer-1处理显著缩短了KA小鼠的逃避潜伏期，增加了平台穿越次数和在目标象限的停留时间，改善了其学习和记忆缺陷。Nissl染色显示，DHA或Fer-1处理减轻了KA诱导的海马CA1、CA3和齿状回(DG)区域的神经元丢失。
2. 2.
   DHA在体内外抑制铁死亡：在KA诱导的癫痫小鼠海马中，SLC7A11和GPX4蛋白表达降低，而DHA或Fer-1处理逆转了这一趋势。TEM观察发现KA组小鼠海马神经元线粒体形态萎缩，这是铁死亡的典型形态学改变，DHA或Fer-1处理显著减轻了这种改变。同时，DHA或Fer-1处理降低了海马组织中升高的Fe²⁺、MDA、4HNE和ROS水平，并恢复了降低的GSH和SOD水平。在HT22细胞中，Glu诱导导致细胞活力下降、SLC7A11和GPX4蛋白表达降低、Fe²⁺、MDA、4HNE和ROS水平升高，GSH和SOD水平降低，而DHA或Fer-1处理同样逆转了这些变化。
3. 3.
   DHA通过激活SIRT1缓解癫痫发作：WB和IF结果显示，DHA处理显著提高了KA小鼠海马中SIRT1的蛋白表达。分子对接预测DHA与SIRT1具有强结合活性。使用SIRT1抑制剂EX-527后，DHA延长SRSs潜伏期、减少发作次数以及对神经元的保护作用均被阻断，表明DHA可能通过激活SIRT1来减轻癫痫发作和神经元损伤。
4. 4.
   DHA通过激活SIRT1抑制铁死亡：在体内，EX-527阻断了DHA对SLC7A11和GPX4蛋白的上调作用，逆转了DHA对线粒体形态的改善，并阻止了DHA对Fe²⁺、GSH、MDA、4HNE、SOD及ROS水平的调节作用。在HT22细胞中，EX-527同样逆转了DHA对细胞活力、SLC7A11和GPX4蛋白表达以及上述铁死亡相关指标的改善作用。这表明DHA在体内外均通过激活SIRT1来抑制铁死亡。
5. 5.
   机制：DHA通过SIRT1去乙酰化FOXO1促进SLC7A11转录：qRT-PCR显示DHA激活了SLC7A11的mRNA水平，而EX-527逆转了这一趋势。通过数据库交叉预测和STRING分析，发现FOXO1是可能调控SLC7A11并与SIRT1相互作用的转录因子。WB结果显示，DHA处理增加了海马组织中FOXO1的蛋白表达并降低了其乙酰化水平(Ac-FOXO1)，同时促进了FOXO1的核转位，而EX-527处理逆转了这些效应。CHIP-qPCR实验直接证实FOXO1能够结合到SLC7A11的启动子区域。这表明DHA通过激活SIRT1，使FOXO1去乙酰化并增强其核转位，进而促进SLC7A11的转录。
6. 6.
   临床验证：在TLE患者的脑组织样本中，与TBI患者相比，SLC7A11和GPX4蛋白表达显著降低，而Fe²⁺浓度显著升高。同时，TLE患者脑组织中的GSH和SOD水平降低，MDA水平升高。这些结果为铁死亡与TLE之间的关联提供了初步的临床证据。

讨论与结论

本研究系统阐述了DHA在癫痫中的治疗潜力及其分子机制。DHA能有效抑制KA诱导的癫痫小鼠的发作、改善认知功能障碍并减少海马神经元损伤。其核心机制在于：DHA激活SIRT1表达，SIRT1使转录因子FOXO1去乙酰化，增强其转录活性及核转位，从而上调SLC7A11的表达。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(Xct)系统的关键组分，其表达增加有助于合成更多的谷胱甘肽(GSH)，进而促进谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的活性。GPX4是抑制脂质过氧化的关键酶，其活性增强最终抑制了神经元铁死亡的发生。这一完整的信号轴被定义为SIRT1/FOXO1/SLC7A11/GPX4通路。此外，对TLE患者样本的分析初步证实了铁死亡在人类癫痫病理中的相关性。综上所述，本研究发现DHA通过激活SIRT1/FOXO1/SLC7A11/GPX4信号通路抑制神经元铁死亡，从而发挥抗癫痫和神经保护作用，为开发新型抗癫痫药物，特别是针对耐药性癫痫的治疗策略，提供了重要的理论依据和潜在的候选化合物。