《Journal of Inorganic Biochemistry》：Structure-activity studies reveal efficient inhibition of urease by Ebsulfur-based compounds
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本研究评估了三种Ebsulfur衍生物对巴氏芽孢杆菌和刀豆尿素酶的抑制效果，发现其可在低微摩尔浓度内有效灭活两种酶。X射线晶体结构分析表明，这些化合物通过αCys322的二硫化作用抑制酶活性，为开发新型抗微生物药物提供了机制依据。
卢卡·马泽伊（Luca Mazzei）| 阿伦达蒂·保罗（Arundhati Paul）| 米凯莱·奇安奇（Michele Cianci）| 安德烈亚·皮齐（Andrea Pizzi）| 朱塞佩·雷斯纳蒂（Giuseppe Resnati）| 斯特凡诺·丘尔利（Stefano Ciurli）
博洛尼亚大学药学与生物技术系（FaBiT）生物无机化学实验室，意大利博洛尼亚，邮编I-40138
摘要
抗菌素耐药性是21世纪最严重的全球健康威胁之一，迫切需要制定新的治疗策略。尿素酶是一种依赖镍的酶，在人类蛋白质组中不存在，因此成为药物开发的理想靶点，因为多种表达尿素酶的细菌病原体在致病过程中起着关键作用。为了发掘抗菌分子的潜力，需要采取替代策略，例如药物再利用。在这方面，有机硒化合物Ebselen显示出良好的尿素酶抑制作用，但其治疗应用受到毒性的限制。Ebsulfur是Ebselen的硫类似物，可能是一种更安全的替代品。在本研究中，我们评估了三种Ebsulfur衍生物对Sporosarcina pasteurii和Canavalia ensiformis尿素酶的抑制能力。生化实验表明，这些化合物在低微摩尔浓度范围内能有效失活细菌和植物中的尿素酶。Sporosarcina pasteurii尿素酶与两种衍生物共结晶的X射线晶体结构（分辨率1.95–1.96 ?）显示，其抑制机制涉及催化关键位点αCys322残基的双硒化。这些发现为Ebsulfur衍生物作为抗菌剂的潜力提供了见解，有助于解决抗生素研发进展缓慢的问题，并为针对耐药病原体的替代抗菌策略的发展做出贡献。
引言
抗菌素耐药性已成为21世纪十大公共卫生威胁之一，导致数百万人死亡并造成巨大的社会经济成本[1]、[2]。据估计，每年约有770万人死于细菌感染，其中490万例与耐药病原体有关，130万例直接由耐抗生素的细菌病原体引起[3]。自2017年以来，世界卫生组织发布了《细菌优先病原体名单》（BPPL），旨在指导针对具有公共卫生重要性的细菌病原体的研究、开发和控制抗菌素耐药性的策略[4]。2024年的更新版BPPL列出了多种细菌物种，如Klebsiella pneumoniae、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Proteus mirabilis和Haemophilus influenzae，这些细菌都表达尿素酶这种依赖镍的酶，能够将尿素水解为二氧化碳和氨[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。这些细菌的致病性与它们的尿素酶活性密切相关，尿素酶活性会导致pH值升高以及微生物微环境和宿主体内氨的积累，从而增加毒性[14]、[15]。除了这些微生物外，Helicobacter pylori也是一种典型的尿素酶产生细菌，它定植在酸性胃环境中，引发胃炎，并增加患十二指肠溃疡、胃癌和淋巴瘤的风险[11]、[16]、[17]。
尿素酶作为毒力因子的关键作用，以及它不存在于人类基因组中，使其成为针对耐药病原体相关疾病的药物发现目标。然而，近年来抗菌药物研发的持续停滞阻碍了这一潜力，限制了有效疗法的发展[18]、[19]。这一挑战可以通过药物再利用来解决，即识别新的分子靶点和现有药物的新的用途。这种方法绕过了传统药物发现流程的复杂性，提供了更高效且更具成本效益的药物开发途径。
在这种背景下，有机硒化合物Ebselen（2-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮）最近被认为是一种有前景的药物再利用候选物（图1）。Ebselen对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株具有抗菌活性[21]、[22]，并已进行了多项临床试验，用于治疗多种疾病。除了其作为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）模拟物的已知氧化还原活性外，Ebselen还被研究用于治疗急性缺血性中风、糖尿病、梅尼埃病和急性噪音引起的听力损失等[23]。这种广泛的治疗潜力表明Ebselen与多种分子靶点相互作用，特别是含有巯基的蛋白质。支持这一假设的是，Ebselen已被证明能通过共价修饰保守且关键的半胱氨酸残基来失活不同来源的尿素酶[24]、[25]、[26]，这一点通过用Ebselen衍生物处理的Sporosarcina pasteurii尿素酶（SPU）的X射线晶体结构得到证实[25]。具体来说，αCys322（SPU编号）的巯基发生双硒化反应，这一过程由相邻的保守组氨酸残基（αHis323）介导[25]。αCys322-αHis323催化二聚体位于一个螺旋-转角-螺旋结构（移动瓣）的顶端，这对尿素酶活性至关重要。该结构可以处于“开放”或“关闭”状态：在“开放”状态下，它有助于底物和产物通过连接溶剂与催化腔的活性位点通道；在“关闭”状态下，它调节催化过程中活性位点内关键氨基酸残基的定位，其中αCys322-αHis323催化二聚体参与质子向反应中间体的转移（图1）。Ebselen处理后形成的共价加合物通过阻止瓣在催化过程中的正确闭合以及αCys322-αHis323二聚体参与催化机制，从而抑制酶活性[25]。
Ebselen及其衍生物的巯基氧化特性被认为是Ebselen及其同类有机硒化合物长期毒性的主要分子基础[28]。大量文献表明，Ebselen作为治疗药物的潜力可能受到其毒性的限制[28]、[29]、[30]、[31]、[32]，包括线粒体功能障碍[33]、[34]、[35]、基因毒性和DNA损伤[36]、[37]、含巯基和锌的转录因子DNA结合机制的改变[38]以及诱导细胞凋亡[39]。事实上，硒的效应取决于其浓度，这种现象被称为“硒悖论”[40]。在低浓度（低于0.1 μM）下，硒缺乏与多种健康问题相关，包括心肌病和病毒感染的易感性增加。在最佳浓度范围内（约1 μM），硒作为抗氧化剂发挥作用，促进调节活性氧（ROS）的硒蛋白的表达[41]。然而，在较高浓度（1–10 μM）下，硒可能具有促氧化作用，这一特性已被用于潜在的抗癌应用[42]、[43]。
据报道，Ebsulfur（Ebselen的硫类似物）的细胞毒性高于Ebselen本身[44]，而其他研究表明，Ebsulfur及其衍生物（包括N-烷基化合物）的溶血活性低于Ebselen[45]。
在本研究中，测试了三种Ebsulfur衍生物（化合物1、2和3，见图1），以评估它们对Sporosarcina pasteurii和Canavalia ensiformis（刀豆）尿素酶（JBU）的抑制作用。此外，所选衍生物还帮助我们评估了烷基取代基对氮原子的影响：化合物2含有亲水链，化合物3含有疏水链，化合物1作为参考。生化抑制实验表明，这些Ebsulfur衍生物在低微摩尔浓度范围内能有效失活细菌和植物中的尿素酶。在两种测试化合物存在下共结晶的SPU的高分辨率X射线结构揭示了这种反应性的分子基础。其机制涉及αCys322巯基的双硒化反应，与Ebselen观察到的现象类似[25]，从而导致尿素酶失活。
试剂和酶的制备
化合物1购自德国卡尔斯鲁厄的ABCR公司，无需进一步纯化即可使用。化合物2和3根据文献中先前报道的程序合成并进行了表征[46]。从Sporosarcina pasteurii中纯化的尿素酶（SPU，摩尔质量：250 kDa）[47]、[48]、[49]，并在4°C下以11 mg/mL的活性蛋白浓度储存于50 mM HEPES缓冲液、150 mM NaCl、50 mM Na2SO3和2 mM EDTA中，pH值为7.5。
结果与讨论
为了评估Ebsulfur衍生物1、2和3作为尿素酶抑制剂的效力，我们对SPU和JBU进行了剂量-反应研究。所研究的抑制剂浓度范围为0.2 μM至0.5 μM，孵育时间为1小时。所得半对数剂量-反应曲线见图2（实验数据也见表1-SI）。在所有情况下，实验数据均呈现近似S形曲线，Hill斜率在1.8–2.1之间。
结论
抗菌素耐药性的上升要求创新的治疗策略，特别是针对依赖尿素酶活性生存和致病的细菌病原体。我们的研究表明，Ebsulfur衍生物能有效抑制细菌尿素酶，为其作为抗菌剂的潜在开发提供了机制基础。结构分析证实，这些化合物作用于催化半胱氨酸残基，通过双硒化导致酶失活。
CRediT作者贡献声明
卢卡·马泽伊（Luca Mazzei）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、研究、数据管理、概念构思。阿伦达蒂·保罗（Arundhati Paul）：撰写——审稿与编辑、研究。米凯莱·奇安奇（Michele Cianci）：撰写——审稿与编辑、方法学、数据管理。安德烈亚·皮齐（Andrea Pizzi）：撰写——审稿与编辑、资源获取。朱塞佩·雷斯纳蒂（Giuseppe Resnati）：撰写——审稿与编辑、资源管理、概念构思。斯特凡诺·丘尔利（Stefano Ciurli）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资金筹集、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了金属-蛋白质磁共振联盟（CIRMMP）、“NICE – 自然启发晶体工程”（PRIN2020）项目以及博洛尼亚大学的支持。
