在柑橘粉虱（Diaphorina citri）中，瞬时受体电位通道在温度胁迫下的分子特性与表达谱研究

《Journal of Insect Physiology》：Molecular characterizations and expression profiles under temperature stress of transient receptor potential channels in Diaphorina citri

TRP通道基因在亚洲柑橘蚜免疫响应与温度适应中的功能研究。通过基因组分析鉴定了12个TRP基因并分为7个亚家族，RT-qPCR显示其广泛表达于不同发育阶段和组织的蚜虫中，DcTRPML、DcTRPL和DcWtrw基因在CLas感染免疫中表达显著差异。温度胁迫实验表明这些基因转录水平显著上调，提示其参与温度应答调控，为开发靶向TRP通道的新型杀虫剂提供资源。

　　

刘天生|宾敏良|张红宇|易干军

广东省农业科学院果树研究所，广州510640，中国

摘要

瞬时受体电位（TRP）通道在响应外部环境和调节昆虫体内平衡方面起着关键作用。近年来，TRP通道因其在调节多种昆虫行为中的重要作用而受到广泛研究，并已成为杀虫剂或驱虫剂的潜在分子靶点。本研究在柑橘木虱（Diaphorina citri）的基因组中鉴定并分析了12个TRP基因。柑橘木虱是一种极具破坏性的害虫，由于它是亚洲柑橘黄龙病（HLB）的病原体Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）的传播媒介，因此已成为全球性问题。研究结果表明，D. citri中的TRP家族基因被分为七个亚家族，包括三个TRPA亚家族、两个TRPV亚家族、一个TRPN亚家族、TRPP亚家族、TRPM亚家族和TRPML亚家族。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）实验显示，TRP通道基因在D. citri的不同发育阶段和组织中均有广泛表达。DcTRPML、DcTRPL和DcWtrw基因的表达水平与对照组有显著差异，表明它们在对抗CLas感染的过程中发挥着重要作用。为了研究TRP基因对温度变化的潜在作用，我们检测了它们在低温和高温胁迫下的表达水平。结果表明，大多数TRP基因的转录水平显著上调，这表明它们参与了D. citri对温度胁迫的响应。我们的发现为开发针对这些重要离子通道的新方法提供了重要信息和资源。

引言

瞬时受体电位（TRP）通道超家族在原核生物和真核生物中广泛存在（Ja?lan等，2020；Diver等，2022）。TRP通道表达在许多细胞的质膜上，对多种生理过程的调节至关重要，包括视觉、味觉和进食行为、温度感知、化学感应、机械感应、湿度感应等，以及感知外部环境的能力（Cosens和Manning，1969；Venkatachalam和Montell，2007；Song和Yuan，2010；Fowler和Montell，2013；Depetris-Chauvin等，2015；Startek等，2019）。1969年，第一个TRP基因在表现出视觉障碍的Drosophila melanogaster突变体中被鉴定出来，因此被命名为“瞬时受体电位”蛋白（Cosens和Manning，1969），而人类同源基因则于1995年首次被报道（Montell等，2002）。TRP通道在结构上高度保守，包括六个跨膜结构域以及细胞内的N端和C端区域，这些区域包含调控位点和相互作用基序（Zhao等，2021；Diver等，2022）。TRP家族被分为七个亚家族：TRP-Canonical（TRPC）、TRP-Ankyrin（TRPA）、TRP-Vanilloid（TRPV）、TRP-Melastatin（TRPM）、TRP-Mucolipin（TRPML）、TRP-Polycystin（TRPP）和TRP-No mechanoreceptor potential C（TRPN）（Montell，2005；Madej和Ziegler，2018；Sinica和Vlachová，2021）。根据TRP通道的氨基酸序列和拓扑结构差异，这七个亚家族可以进一步分为两组。第一组包含五个亚家族：TRPC、TRPA、TRPN、TRPV和TRPM；第二组包括剩余的TRPP和TRPML亚家族（Venkatachalam和Montell，2007）。第八个TRP家族在酵母中被鉴定出来，命名为TRPY（Y代表酵母）（Li，2017）。TRPC亚家族是研究最广泛的亚家族，包括TRP、TRPL和TRPgamma，它们参与光响应和避免低温（Rosenzweig等，2005；Montell，2012；Feng，2017）。TRPA亚家族有四个成员：TRPA1、Pain、Pyx和Wtrw，其N端结构域中含有大量的ankyrin重复序列，在应对极端温度和刺激物方面起着重要作用（Karashima等，2009；Kwon等，2010；Zhong等，2012）。TRPN亚家族的唯一成员NompC含有最多的ankyrin重复序列，已被证明对触觉感知和运动至关重要（Sidi等，2003；Cheng等，2010；Yan等，2013）。TRPV通道包括TRPV1，它们参与检测高温、酸或辣椒素（Niemeyer，2005；Phelps等，2007；Zhang等，2013）。在Drosophila中，TRPM亚家族没有ankyrin重复序列，TRPM1的首次克隆发生在1998年，它们与多种生物过程相关，例如温度和氧化还原感应、胰岛素分泌（Duncan等，1998；Huang等，2020）。在第二组中，TRPP和TRPML亚家族均缺乏ankyrin重复序列。TRPP亚家族包括Polycystin-2（Pkd2）和Brivido1-3（Brv1-3）。Pkd2与精子储存有关（Gao等，2003）。Brivido蛋白含有8-10个跨膜段而不是6个，与对低温的热趋性反应相关（Gallio等，2011；Bellemer，2015）。TRPML亚家族介导钙（Ca²⁺）和铁（Fe²⁺）离子从溶酶体释放到细胞质中，还参与自噬和凋亡细胞的清除（Zeevi等，2009）。

近年来，许多TRP通道成员逐渐成为杀虫剂的潜在分子靶点（Nesterov等，2015；Kandasamy等，2017；Maienfisch，2019；Ali等，2022；Paschapur等，2025）。商业杀虫剂和驱虫剂主要针对TRP通道，尤其是TRPV和TRPA（Nagata，2007；Salgado，2017；Kandasamy等，2022）。两个TRPV通道亚基Nan和Iav已被证明是杀虫剂pymetrozine和pyrifluquinazon的分子靶点（Nesterov等，2015）。这是首次发表关于杀虫剂靶向TRP通道的研究。Flonicamid是一种4-三氟甲基烟酰胺（TFNA-AM）的前体杀虫剂，是一种强效的 chordotonal 器官调节剂。此外，TFNA-AM并不直接作用于TRPV通道（Kandasamy等，2017），而是通过一个导致TRPV通道激活的途径起作用（Spalthoff等，2022）。TRPA1是有机磷杀虫剂的主要介导因子（Ding等，2017）。最近的研究发现，Wtrw可以被afidopyropen、pymetrozine和nicotinamide激活（Kandasamy等，2022）。TRPA和TRPV通道具有特异性，可以有效调节chordotonal器官的功能，从而有效控制害虫（K?rki和Tojkander，2021；Huang等，2023；Rosenbaum和Islas，2023）。其他TRP亚家族也被鉴定为杀虫剂的潜在分子靶点，如TRPA1（Manwill等，2020）、TRPM（Shimomura等，2021）、TRPL和TRPgamma（Tian等，2022）。总之，随着越来越多的TRP通道基因结构被研究，杀虫剂与TRP通道的结合已成为杀虫剂研究的热点，为杀虫剂毒性和药物开发提供了新的策略。

亚洲柑橘木虱（ACP），Diaphorina citri，是亚洲柑橘黄龙病（HLB）的病原体Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）的传播媒介，这是世界上最危险的柑橘病害（Halbert和Manjunath，2004；Bové，2006；Gottwald，2010；Wang等，2017）。ACP和HLB存在于世界上一些柑橘生产最丰富的地区，如美洲、巴西和中国（Narouei-Khandan等，2016；Singerman和Rogers，2020）。迄今为止，尚无针对HLB的治疗手段，也没有商业化的柑橘品种对其具有抗性（Wang，2019）。因此，有效管理ACP已成为HLB研究的重点（Li等，2020）。目前，由于化学控制方法的高效性，化学控制仍然是D. citri管理的关键手段（Grafton-Cardwell等，2013；Boina和Bloomquist，2015）。然而，ACP正在发展出杀虫剂抗性，这导致了严重的环境问题和更高的生产成本（Bassanezi等，2020；Milne等，2020；Chen等，2021；Antolínez等，2023）。因此，寻找控制ACP种群的替代策略至关重要。

尽管已经在不同的昆虫中发现了许多TRP通道，如D. melanogaster（Cosens和Manning，1969；Montell等，2002）、Tribolium castaneum（Kim等，2015）、Apis mellifera（Kohno等，2010）、Bombyx mori（Matsuura等，2009；Kiya等，2014）、Anopheles gambiae（Wang等，2009；Liu和Zwiebel，2013）、Solenopsis invicta（Wang等，2018）、Bactrocera dorsalis（Su等，2018）、Pieris rapae（Mao等，2020）、Nilaparvata lugens（Wang等，2021）、Spodoptera frugiperda（Zhang等，2024；Su等，2025），但TRP通道在农业害虫ACP中的功能作用仍不明确。

在本研究中，我们在D. citri基因组中鉴定并克隆了12个TRP基因，并研究了它们在不同发育阶段和组织中的表达模式。我们的研究为未来的功能研究奠定了基础，有助于深入了解TRP蛋白在ACP中的作用，并可能促进创新害虫控制方法的发展。

实验部分

昆虫

在广东省农业科学院的温室中，使用Murraya paniculata作为培养基，维持相对湿度60±5%和温度27±1℃，光照周期为16L:8D，饲养了一组易感的D. citri实验室种群。

热刺激

在16℃至34℃的温度范围内对ACP成虫进行了研究，使用了温度控制的培养箱。每种处理条件下，将20只ACP成虫释放到Murraya paniculate上，环境箱的湿度维持在60±5%，光照周期为16L:8D。

ACP中TRP基因的鉴定

TRP

DcTRPs的鉴定和分子特征分析

在D. citri的染色体水平基因组中鉴定并确认了12个候选TRP基因。所有基因均使用专门设计的引物通过PCR扩增以确认其序列（表S2）。我们获得了所有12个DcTRP基因的全长序列。基因特征在表1中提供，包括氨基酸序列长度（AAs）、分子量（Mw）、等电点（pI）和平均疏水性（GRAVY）。氨基酸序列长度从637（DcTRPML）到1558不等

讨论

在这项工作中，我们进行了全面分析，鉴定并克隆了D. citri基因组中的12个TRP基因，这些基因根据结构和系统发育分析被分为七个亚家族：TRPN（NompC）、TRPP（Pkd2）、TRPM、TRPML、TRPC（TRPC、TRP和TRPL）、TRPV（Iav和Nan）以及TRPA（TRPA1、Pain和Wtrw）。此外，多重序列比对、基因结构分析和系统发育分析证实了这些分类的准确性和进化关系

结论

总结来说，在D. citri基因组中鉴定并克隆了12个TRP基因，这些基因可以根据结构特异性和同源性分为七个亚家族。转录组分析表明，TRP基因在发育过程中其表达水平具有动态变化。根据基因表达结果，一些DcTRP基因可能参与了对抗CLas感染的免疫反应，这需要进一步研究它们的精确功能

CRediT作者贡献声明

刘天生：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，研究，数据管理。宾敏良：软件使用，方法学设计。张红宇：监督，资金获取。易干军：监督，资源提供，项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

资助

本项工作得到了国家园艺作物种质创新利用重点实验室（Horti-KF-2023-09）的资助。