《Andrology》：Microfluidic Intracytoplasmic Sperm Injection (MICSI): A Novel Platform for Sperm Isolation, Selection, and Injection Into Oocytes
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本文介绍了一种创新的微流控卵胞浆内单精子注射 (MICSI) 平台。该平台将微流控技术集成到现有ICSI培养皿中，实现了在一次性耗材上完成精液处理、基于运动性与透明质酸 (HA) 结合的精子优选，以及卵母细胞授精准备。与传统密度梯度离心 (DGC) 相比，该设备能够筛选出具有更高前向运动力、更优形态和更低DNA碎片指数 (DFI) 的精子亚群，为临床提供了可替代的、高质量精子选择方案。
1 引言
不孕不育是全球紧迫的健康问题，影响着全球约六分之一的夫妇。辅助生殖技术 (ART) 周期的失败率仍高达约78%，其中技术进步有限是主要原因之一。精子处理是决定ART成功和子代健康的关键环节，但技术革新缓慢。目前“金标准”方法如密度梯度离心 (DGC) 存在医源性损伤和DNA损伤的风险。相比之下，微流控精子选择技术通过模拟女性生殖道的微观结构，利用精子独特的运动行为，展现出巨大潜力。然而，现有商业化微流控方法多依赖精子穿过微孔滤膜的简单能力，或使用难以临床转化的不实用机制。本研究旨在开发一种概念验证性的微流控ICSI (MICSI) 平台，将微流控结构整合到商业化ICSI培养皿的熟悉形式中，以促进精子选择，并具备在同一平台上进行卵母细胞授精的潜力。该平台重点关注利用精子对卵丘基质中透明质酸 (HA) 的结合能力，这种相互作用已被证明能有效选择具有活力的成熟精子，并与精子DNA损伤呈负相关。
2 材料与方法
2.1 设备制造与结构
MICSI设备采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 通过精密3D打印模具工艺制造。其基座培养皿设计可容纳0.2 mL未经处理的液化精液，并包含一个通道顶盖，在精液和设备的其余部分之间形成边界。通道长5 mm。设备末端有一个100 μm的陡降台阶，有助于防止沉降的精子返回精液储存区。随后是用于HA微图案化涂层结合精子的平坦区域，以及培养皿右侧预留用于在矿物油下分离卵母细胞液滴的空间。设备结构模仿了女性生殖道的迁移路径。
2.2 PDMS表面HA涂层
通过多巴胺 (PDA) 中间层将HA结合到PDMS表面。首先在PDMS表面形成PDA涂层，然后将其浸入HA溶液中以实现HA/PDA功能化。使用FITC偶联的HA和阿尔新蓝染色验证了HA涂层的均匀性。
2.3 精液收集与处理
人类精液样本来自25至34岁的正常精液参数供者，遵循世界卫生组织 (WHO) 建议，禁欲2-4天后通过手淫收集。所有样本在室温下液化20分钟。参与者均签署知情同意书。
2.4 MICSI设备操作
该PDMS芯片的通道通过局部等离子体处理变得亲水。设备置于37°C加热块上的湿润环境中。首先用缓冲液 (GxMOPS Plus) 灌注微通道，然后用粘稠的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 覆盖HA微图案区域。将0.2 mL精液加入设备左侧的精液区。设备的斜坡和通道顶盖可防止精液流入下游区域。右侧放置模拟ICSI准备的液滴并覆盖矿物油以防止蒸发。随后观察精子迁移和结合过程，并通过显微操作ICSI针收集结合的精子。
2.5 常规DGC方法
作为对照，使用SpermGrad密度梯度介质进行DGC。将精液铺在梯度液上，离心后收集沉淀，用缓冲液重悬并再次离心，最终获得用于分析的精子悬液。
2.6 研究设计与评估参数
研究分两部分评估MICSI设备的效能，并与常规DGC比较。首先，评估仅使用MICSI芯片第一阶段（无HA结合）从原始精液中分离精子的能力，与DGC对比，评估参数包括精子运动力、浓度、DFI和形态。其次，评估精子分离结合HA结合选择的效果，将分离出的精子暴露于HA微图案表面，评估运动精子结合评分、DFI和形态。
2.7-2.10 分析评估方法
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精子基本参数：按照WHO指南，在200×相衬显微镜下评估精子浓度和前向运动力百分比。
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精子DNA碎片指数分析：使用精子染色质结构分析 (SCSA) 评估。通过吖啶橙染色和流式细胞术区分完整DNA（绿色荧光）和碎片化DNA（红色荧光），计算DFI。
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精子形态评估：使用Diff-Quik染色，在1000×油镜下评估。本研究所用为非严格形态学评估方案，结果以形态异常精子百分比表示。文中强调该方法与WHO推荐的严格巴氏染色法存在差异，结果主要用于方法学间的相对比较。
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精子结合评分：计算结合在HA表面的不动精子数量占视野中运动精子总数的百分比，在5分钟间隔内评估直至20分钟，以此作为精子功能成熟度的指标。
2.11 统计分析
使用GraphPad Prism进行统计分析。对浓度、前向运动力、DFI和形态学数据，采用单因素重复测量方差分析 (ANOVA)，并进行Bonferroni校正的事后比较。结合评分采用双尾配对t检验。P < 0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 设备功能性
MICSI方法在时间上显著优于常规DGC技术。精子可在几分钟内从精液储存区迁移通过微通道并开始结合HA，而DGC结合HA的方法通常需要40-60分钟。
3.2 精子分析与DFI
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浓度：DGC和MICSI处理后的精子浓度均较原始精液显著降低，但两者之间无显著差异。
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前向运动力：MICSI设备筛选出的精子前向运动力 (95.46 ± 0.65%) 显著高于原始精液 (56.61 ± 2.05%) 和DGC方法 (80.23 ± 1.22%)。
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DNA碎片指数：原始精液DFI最高 (12.27 ± 0.5%)。DGC处理后DFI显著降低 (4.19 ± 0.28%)，HA结合后进一步降低 (0.94 ± 0.05%)。MICSI处理本身就能将DFI显著降低至1.48 ± 0.06%，优于DGC，而MICSI结合HA筛选出的精子亚群DFI最低 (0.8 ± 0.03%)。
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形态学：原始精液中形态异常（非严格）比例最高 (31.38 ± 2.7%)。DGC和MICSI处理均能显著降低该比例。MICSI单独处理相比DGC能更显著地减少形态异常精子比例。文中再次强调该结果为非严格评估，不可与WHO6严格标准直接比较。
3.3 HA结合效率
MICSI设备筛选出的精子对HA微图案的结合评分 (91.88 ± 0.57%) 显著高于DGC处理后的精子 (76.71 ± 1.48%)。此外，在15分钟内，每个HA液滴平均可结合约239个精子。
4 讨论
本研究开发并测试了MICSI平台，这是一个旨在将精子分离、激活、生理性选择和卵母细胞注射整合在单一平台上的微流控ICSI设备。与常规DGC相比，MICSI能产生具有更高前向运动力、更佳DNA完整性和更强HA结合能力的精子。降低精子DFI至关重要，因为高DFI与胚胎发育潜能降低、着床率下降和流产风险增加相关。尽管DGC结合HA也能达到类似效果，但数据显示DGC处理后的精子结合HA的能力较低，这与离心可能损害精子表面结构（如HA受体）有关。MICSI模拟了更接近生理的环境：微通道阵列模拟了精子在宫颈和子宫中的迁移，而HA结合则模拟了卵母细胞周围的卵丘细胞。这避免了离心和密度梯度介质可能带来的活性氧 (ROS) 升高和对精子获能相关表面蛋白的干扰。虽然本研究未直接测量临床妊娠结局，但已有充分数据将精子DFI与较低的着床率或活产率联系起来，因此MICSI降低DFI的能力可能具有潜在的临床益处。
5 局限性与未来方向
本研究使用的精液样本来自推定具有生育力的正常精液参数供者，未来需要在临床不育患者（如少弱畸精子症）样本中进行测试，以评估其临床效用。同时，需在DNA碎片率较高 (>30%) 的样本中验证其降低DFI的能力。本研究的形态学评估采用非严格标准，存在局限性，结果应理解为在恒定方案下的相对差异。未来可探索除HA外的其他生物标志物（如HSPA2、GRP78等）用于精子优选。此外，在精子浓度和运动力极低的样本中，该设备的适用性也有待验证。
6 结论
MICSI设备原型为ICSI过程中选择高运动力、低DFI的精子提供了一个潜在的实用型单步解决方案。通过将微流控通道集成到传统ICSI培养皿中，该设备可适配现有临床工作流程，并规避离心前处理的需要。实验证明，该设备能在培养皿制备后5分钟内完成精子的分离、选择和结合，且所获精子在DNA质量和成熟度方面优于常规DGC。在受控的临床前环境中，MICSI设备在特定参数上超越了当前临床标准DGC及DGC结合HA的方法。尽管这仍是一个概念验证原型，但它提供了一种形式，有望减少精子操作步骤、降低与离心相关的医源性损伤风险，并减少ICSI过程中精子选择的主观性。
