霍乱弧菌NFeoB的完整催化循环结构

《Journal of Molecular Biology》：The structure of the full catalytic cycle of Vibrio cholerae NFeoB

霍乱病原体Vibrio cholerae的FeoB蛋白及其NFeoB结构域的催化循环通过X射线晶体学解析，揭示了多种构象状态，明确了其铁离子转运机制及在致病中的作用，为开发新型抗霍乱药物提供结构基础。

　　

Kate Magante|Candice M. Armstrong|Mark Lee|Aaron T. Smith

美国马里兰州巴尔的摩县马里兰大学化学与生物化学系，邮编21250

摘要

铁的获取对许多传染性病原体的生存和毒力至关重要，大多数细菌通过利用铁转运系统（Feo）来获取亚铁（Fe²⁺）。FeoB是该系统的主要组成部分，其功能由其可溶性的细胞质结构域NFeoB调控。我们最近开始研究霍乱弧菌（Vibrio cholerae）中Feo系统的结构和机制，这种细菌是霍乱的致病菌。然而，我们对霍乱弧菌NFeoB的结构仍存在许多未知之处。在这项研究中，我们获得了几种新的X射线晶体结构，揭示了NFeoB结构域在某些不常见且前所未有的状态下的结构，从而阐明了这种NTP酶的完整催化循环。这些发现揭示了NFeoB的重要功能特性，未来可能被用于预防霍乱的传染性和传播。

部分内容摘要

引言

生物体获取铁是至关重要的，因为这种必需的微量元素在许多生物过程中起着关键作用，如氧化磷酸化、DNA生物合成、细胞呼吸甚至氮气固定。尽管铁的重要性不言而喻，但我们对微生物如何获取铁的理解仍然有限，这导致我们在了解铁与人类疾病之间的关联方面存在重大空白。对于宿主体内的传染性细菌而言，...

VcNFeoB结合核苷酸形式的结晶

为了完整地研究其催化循环，我们采用了与之前类似的方法制备了高纯度的VcNFeoB。[31] 简而言之，我们首先表达了带有N端（His）₆标签的VcNFeoB蛋白的SUMO融合蛋白，并进行了纯化。经过切割、标签分离和纯化后，得到的VcNFeB在溶液中主要为单体形式（通过尺寸排阻色谱和质谱分析确认，见图S1）。这种溶液状态下的寡聚现象与我们的先前研究结果一致。

讨论

在这项研究中，我们获得了几种新的X射线晶体结构，从而能够模拟霍乱弧菌NFeoB的完整催化循环（见图7）。虽然NFeoB结构域已在多种细菌物种中进行了生化和结构研究[44, 45, 46, 47]，但来自单一物种的NFeoB的完整催化循环仍不清楚，尤其是其过渡态结构仅在一个嗜热细菌中得到证实。

方法

材料本研究中使用的所有密码子优化基因均由GenScript公司合成并验证。用于缓冲液制备、蛋白质表达和纯化的材料均来自标准商业供应商，按接收时的状态直接使用。GDP和GMP-PCP由MilliporeSigma公司提供，并在-20°C下保存直至使用。VcNFeoB的克隆、表达和纯化我们使用了针对霍乱弧菌FeoB N端NTP酶结构域的SUMO融合表达质粒进行实验。

CRediT作者贡献声明

Kate Magante：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、数据分析、数据管理。Candice M. Armstrong：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、数据分析、数据管理。Mark Lee：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构思。Aaron T. Smith：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目监督、资金管理

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了NIH-NIGMS资助（项目编号R35 GM133497，A.T.S.；项目编号T32 GM158458，C.A.和A.T.S.；以及NSF资助（项目编号2207374，K.M.）。NSLS-2是美国能源部科学办公室管理的用户设施，依据合同号DE-SC0012704运营。本研究的成果基于使用NE-CAT BAG提案# 317877获得的实验时间完成的实验数据。作者感谢Michael F. Summers教授（UMBC和HHMI）提供的MicroCal Automated PEAQ-ITC仪器支持。